一、转化生长因子β_1与类风湿关节炎滑膜病理改变的关系（论文文献综述）
汪洋[1]（2021）在《LncRNA PlncRNA-1靶向miR-146a/TGF-β1轴参与类风湿性关节炎发生发展机制研究》文中研究说明研究目的:类风湿性关节炎是一种常见的对称性多关节炎为主要临床表现的自身免疫性疾病,类风湿性关节炎的病因及发病机制较为复杂,目前尚不清楚。近些年来研究证实非编码RNA通过靶向下游相关基因参与到类风湿性关节炎发生及发展过程中。基于此,本论文从以下三个方面展开讨论:从临床研究角度探究Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1对类风湿性关节炎患者病情严重程度的评估价值。从细胞学的角度探究Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a/TGF-β1轴之间的靶向关系,并且探究三者调控滑膜成纤维细胞增殖、迁移、侵袭性能研究,为临床探究类风湿性关节炎病理机制提供理论基础。从体内动物模型探究Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a、TGF-β1因子参与类风湿性关节炎发生及发展的机理,确定Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a、TGF-β1对其大鼠体内炎性因子的调控行为。方法:（1）选取30只Wistar雌性大鼠,构建II型胶原诱导型关节炎CIA大鼠模型,设置Control组、Model组;确定模型建立成功性;RT-PCR检测各组大鼠关节滑液及滑膜组织内Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1浓度表达;ELISA检测大鼠关节滑液及滑膜组织内炎性因子浓度表达;TUNEL法检测滑膜组织细胞凋亡指数;确定滑膜组织内Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1表达与炎性因子及凋亡指数之间的相关性。（2）临床研究:选取在我院确诊的70例类风湿性关节炎患者,根据是否处于活动期分为活动期RA（n=34）和非活动期RA（n=36）两组患者,选择同期40例健康体检人员作为对照组;RT-PCR检测血清内Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1浓度表达;ELISA检测血清内CRP、ESR、INF-γ、TNF-α、IL-17及IL-10因子表达浓度;Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1表达与因子CRP、ESR、INF-γ、TNF-α、IL-17及IL-10之间的相关性;受试者血清内Lnc RNA Plnc RNA-1与mi R-146a、mi R-146a与TGF-β1及Lnc RNA Plnc RNA-1与TGF-β1三组浓度表达之间的相关性;ROC曲线分析Lnc RNA Plnc RNA-1对活动期RA的诊断价值。（3）体外细胞研究:选取滑膜成纤维细胞（RA-FLS）作为研究对象,原代培养,选取P3细胞作为研究对象;细胞经LPS处理后分别转染Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1过表达及敲除质粒,设置Control组、pc DNA-Plnc RNA-1、si Plnc RNA-1、pc DNA-mi R-146a、pc DNA-Plnc RNA-1+mi R-146a及pc DNAPlnc RNA-1+mi R-146a+TGF-β1组,细胞继续培养48小时;RT-PCR确定各组细胞内Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1转染成功性;双荧光素酶基因法确定Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1三者之间的靶向调控性;CCK-8检测细胞增殖活性;Annexin V法检测各组细胞凋亡能力;ELISA检测炎症因子INF-γ、TNF-α、IL-17及IL-10的浓度表达;划痕实验及Transwell实验确定细胞的迁移及侵袭情况;WB检测迁移侵袭及细胞增殖相关蛋白的浓度表达。结果:（1）模型建立成功性验证:三周后模型组大鼠模型建立后第四周,模型组大鼠关节表面皮肤充血粉红发亮;对照组大鼠的关节无明显的红肿现象,活动正常;3周及4周对照组大鼠体重增加快于模型组;模型组大鼠后足容积逐渐增加,在模型建立后2周、3周及4周（P<0.05）;随着时间的延长,模型组大鼠关节炎指数增加（P<0.05）;病理形态分析对照组大鼠关节面较为光滑,滑膜薄而完整,无明显的组织水肿以及炎性细胞浸润现象;CIA模型大鼠关节腔内滑膜组织有炎性细胞的浸润现象,滑膜细胞增生排列较为紊乱,部分滑膜出现缺失;CIA模型建立后大鼠关节滑液及滑膜组织内Lnc RNA Plnc RNA-1及TGF-β1表达降低,mi R-146a的表达提升（P<0.05）;CIA模型建立后,滑膜组织细胞的凋亡性提升（P<0.05）。CIA模型建立后,大鼠关节滑液以及滑膜组织内炎症因子INF-γ、TNF-α、IL-17的浓度表达增加,IL-10的浓度表达降低（P<0.05）;Lnc RNA Plnc RNA-1、TGF-β1的表达与INF-γ、TNF-α、IL-17的表达体现出负相关性,与IL-10的表达体现出正相关性;mi R-146a的表达与INF-γ、TNF-α、IL-17的表达体现出正相关性,与IL-10的浓度表达体现出负相关性（P<0.05）。（2）临床研究:一般资料:三组受试者的平均年龄、性别比例、病程、BMI指数、基础性疾病（高血压、冠心病、糖尿病）无差异,（P>0.05）;血清及细胞样品内Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1浓度表达趋势相同,RA患者中Lnc RNA Plnc RNA-1、TGF-β1低表达,mi R-146高表达,活动期患者趋势最明显,非活动期次之,对照组最后（P<0.05）;RA患者血清内CRP、ESR、INF-γ、TNF-α、IL-17的表达高于对照组,IL-10浓度表达低于对照组,活动期RA患者炎性因子表达浓度最高（P<0.05）;活动期RA患者血清内Lnc RNA Plnc RNA-1、TGF-β1表达与CRP、ESR、INF-γ、TNF-α、IL-17负相关性明显,与IL-10正相关性,mi R-146体现出相反趋势（P<0.05）;活动期RA血清内Lnc RNA Plnc RNA-1与mi R-146a、Lnc RNA Plnc RNA-1与TGF-β1以及mi R-146a与TGF-β1之间分别体现出负相关性、正相关性、负相关性,其中活动期RA患者相关性最强,非活动期RA患者次之,对照组三者无相关性（P<0.05）;活动期患者、非活动期患者、健康对照组三者的AUC面积分别为0.8611,0.9004及0.6361,三者的95%CI分别为0.7730～0.9493,0.8279～0.9729及0.5263～0.7460,（P<0.05）。（3）Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1质粒在RLS细胞内转染成功,Lnc RNA Plnc RNA-1的过表达可以提升TGF-β1在RLS的表达,抑制mi R-146a表达,（P<0.05）;Lnc RNA Plnc RNA-1的m RNA 3’非编码区预测到一个mi R-146a的结合位点,将野生型和突变型p GL3-Plnc RNA-1-UTR表达载体转染至RLS细胞中,共转染野生型表达载体报告基因活性显着降低（P<0.05）;mi R-146a的m RNA 3’非编码区预测到一个TGF-β1的结合位点,采用共转染技术将不同组合的野生型和突变型p GL3-TGF-β1-1-UTR表达载体得以转染至RLS细胞中,共转染野生型表达载体报告基因活性显着降低（P<0.05）,Target Scan软件分析并未发现Lnc RNA Plnc RNA-1与TGF-β1之间存在一定的结合位点;随着时间的延长,各组RLS细胞均体现出增加的趋势。pc DNA-Plnc RNA-1在RLS细胞内的过表达可以抑制RLS细胞的增殖活性、迁移及侵袭能力及细胞内炎症反应,细胞内Survivin、PCNA、Bcl-2、MMP-2及MMP-9等蛋白浓度均明显降低;促进细胞的凋亡性,Bax及Caspase-3的表达浓度增加(P<0.05。结论:（1）大鼠类风湿性关节炎CIA模型中关节滑液和滑膜组织内Lnc RNA Plnc RNA-1及TGF-β1表达降低,mi R-146a表达提升;Lnc RNA Plnc RNA-1及TGF-β1抑制炎性因子的表达,抑制疾病进展,mi R-146a的表达则提升炎性因子表达,促进类风湿性关节炎的发展。（2）Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1在类风湿关节炎患者血清内存在差异性表达,Lnc RNA Plnc RNA-1、TGF-β1低表达抑制炎症因子浓度表达;mi R-146a高表达促进炎症因子浓度表达;活动期患者Lnc RNA Plnc RNA-1、mi R-146a及TGF-β1三者之间相关性明显,共同调控疾病的发展。（3）Lnc RNA Plnc RNA-1靶向mi R-146a/TGF-β1轴对RLS细胞生物活性产生调控,过表达的Lnc RNA Plnc RNA-1通过抑制mi R-146a的表达和促进TGF-β1因子浓度表达来抑制RLS细胞的增殖活性、迁移及侵袭能力以及炎症反应,促进RLS细胞的凋亡活性,最终抑制类风湿性关节炎的发生及发展过程。
李兆东[2]（2021）在《万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎机制研究及16S rDNA高通量测序和代谢组学分析》文中进行了进一步梳理类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性自身免疫性疾病,具有致残率高,治疗周期长,预后差和易复发等特点,常给患者家属和社会带来沉重负担。成纤维样滑膜细胞（rheumatoid arthritis-fibroblast-like synoviocytes,RAFLSs）是关节滑膜组织的重要组成细胞,其过度增殖可促进免疫细胞释放大量促炎因子,从而引发炎症反应,加剧RA病理进程。此外,关节腔内募集的促炎因子也会进一步激活RA-FLSs细胞。因此,抑制RA-FLSs细胞增殖或降低关节内促炎因子水平是治疗RA的一种有效手段。当前,药物治疗仍是RA的主要治疗方式,但由于化学合成药物的治疗不仅费用昂贵,且常伴有副作用,因此人们正积极寻找安全、有效和廉价的药物来治疗RA。近年来,中药以其具有的显着疗效和较少的副作用,在治疗RA方面已受到越来越多的关注。此外,中药可通过多成分、多途径、多靶点的方式参与RA的治疗过程。万通筋骨片是由25味中药组成的复方药,具有“祛风散寒、通络止痛”的功效,主要用于风湿和类风湿性关节炎等骨性疾病。由于其作用机理不明确,从而限制了它在国内外的推广和使用。因此,系统研究万通筋骨片在治疗RA中的作用和机制十分必要。首先,基于胶原诱导性关节炎（collagen-induced rheumatoid arthritis,CIA）大鼠模型,我们研究万通筋骨片对RA的抗炎作用;其次,基于RA-FLSs细胞的生物学活性,我们研究万通筋骨片对RA的抗炎机制;随后,在万通筋骨片抗炎作用的基础上,我们利用高通量测序技术继续挖掘万通筋骨片的抗炎基因靶点;最后,我们利用16S rDNA高通量测序和代谢组学分析研究万通筋骨片对肠道菌群和血清代谢物谱的影响,拟挖掘参与万通筋骨片抗炎作用的靶点微生物群和靶点代谢物。因此,本研究不仅为万通筋骨片在临床上治疗RA提供了实验依据,促进了其推广和应用,而且也为中药治疗RA的机制研究建立了新的思路。第一部分万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎作用首先,为了确定万通筋骨片的安全给药浓度,我们进行了急性毒性实验,血常规检测和肝脾肾功能分析。其次,为了评估CIA大鼠模型的构建效果,我们检测了大鼠的足趾肿胀度,关节内TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子水平,关节的病理结构变化,以及滑膜组织中FLSs特异性标志蛋白（Vimentin）的表达水平。最后,为了研究万通筋骨片对RA的抗炎作用,我们连续灌胃给药14天和28天后,检测了CIA大鼠足趾肿胀度,炎性关节病理结构变化,以及关节腔和关节组织中TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子水平。结果显示:万通筋骨片给药的安全有效浓度可设为150、300和600 mg/kg;CIA大鼠成模率>99.00%。当连续治疗14天时,各组CIA大鼠足趾肿胀度没有明显变化;当连续治疗28天时,300和600 mg/kg组的CIA大鼠足趾肿胀度明显降低。组织病理切片显示,连续给药14天和28天时,各组CIA大鼠的关节病理结构发生不同程度的改善,尤以600 mg/kg连续给药28天的治疗组CIA大鼠,病理结构改善效果最佳。关节腔内促炎因子的水平变化结果显示,在连续给药14天和28天时,各给药浓度均表现出不同程度的抗炎作用,尤以600 mg/kg连续给药28天的抗炎效果最佳。关节组织中促炎因子的水平变化结果显示,连续给药14天时,TNF-α和IL-1β促炎因子水平显着降低;连续给药28天时,TNF-α,IL-1β和IL-6促炎因子水平明显下调。这些结果说明,万通筋骨片对RA具有抗炎作用,且呈现一定的时间依赖性和浓度依赖性。第二部分万通筋骨片在类风湿关节炎中的抗炎机制基于万通筋骨片的抗炎作用,本研究在细胞水平和动物水平继续研究万通筋骨片的抗炎机制。首先,为了确定万通筋骨片对RA-FLSs细胞增殖的影响,我们观察了RA-FLSs细胞形态变化,并应用乳酸脱氢酶活性测定,Ed U核酸标记以及免疫组化等实验技术检测RA-FLSs细胞数目变化和滑膜组织中Vimentin蛋白表达情况。其次,我们利用蛋白免疫印迹,免疫荧光和免疫组化等技术检测了MEK、p MEK、ERK1/2和p ERK1/2蛋白在RA-FLSs细胞及CIA大鼠滑膜组织中的表达水平。同时,我们还利用ERK1/2质粒转染等相关实验,进一步验证MEK/ERK信号通路在万通筋骨片抗炎过程的作用。最后,为了研究万通筋骨片是否通过诱导滑膜细胞凋亡的方式参与抗炎作用,我们检测了RA-FLSs细胞中caspase-3/9蛋白酶活性,cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的蛋白表达水平,以及CIA大鼠滑膜组织中Bax,Bcl-2,caspase-3和cleaved-caspase-3蛋白表达水平。结果显示:药物处理24 h和48 h后,各组RA-FLSs细胞形态均发生改变,尤以3 mg/ml和4 mg/ml药物浓度处理48 h,细胞形态变化较为明显。药物处理24 h后,各组RA-FLSs细胞数目无明显变化;药物处理48 h后,2 mg/ml、3mg/ml、4 mg/ml给药浓度可以显着抑制RA-FLSs细胞增殖。经药物处理24 h和48 h后,MEK,p MEK,ERK1/2和p ERK1/2蛋白在RA-FLSs细胞中均呈现不同程度的降低趋势,尤以3 mg/ml和4 mg/ml药物浓度处理48 h,各蛋白表达差异最为明显。同时,过表达ERK1/2显着提升RA-FLSs细胞的增殖能力,而过表达ERK1/2的RA-FLSs细胞经3 mg/ml药物浓度处理后,细胞增值能力显着下降。同时,万通筋骨片可以下调MEK,p MEK,ERK1/2和p ERK1/2蛋白在滑膜组织中的表达。此外,药物处理24 h后,4 mg/ml药物浓度显着提高RA-FLSs细胞中caspase-3/9蛋白酶活性;药物处理48 h后,3 mg/ml和4 mg/ml明显上调caspase-3/9蛋白酶活性。我们还发现,药物处理24 h和48 h后,3 mg/ml和4mg/ml药物浓度显着上调cleaved-caspase-3蛋白表达,2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml药物浓度显着上调cleaved-PARP蛋白表达。同时,万通筋骨片可以上调滑膜组织中Bax和cleaved-caspase-3蛋白表达以及下调Bcl-2和caspase-3蛋白表达。这些结果表明,万通筋骨片通过抑制RA-FLSs细胞增殖及诱导RA-FLSs细胞凋亡参与抗炎过程。第三部分基于RNA高通量测序挖掘万通筋骨片在类风湿关节炎中的抗炎靶点基于万通筋骨片对RA-FLSs细胞的影响,本研究针对药物处理后的RA-FLSs细胞进行RNA高通量测序分析。为了更加全面、准确的获得抗炎靶点,我们采用两种不同的分析方法进行筛选,即DESeq2差异分析以及STEM时间序列和WGCNA权重共表达联合分析。DESeq2差异分析:通过DESeq2差异分析,拟筛选不同组别间的差异基因;针对这些差异基因,我们随后进行功能富集过滤和蛋白互作（protein-protein interaction,PPI）网络分析,并根据PPI网络中节点连接度筛选备用核心基因。STEM时间序列和WGCNA权重共表达联合分析:基于药物处理组和未处理组之间的差异基因,我们拟筛选与时间序列具有相同表达趋势的基因。针对这些基因,我们进一步筛选具有相同表达模式的差异基因。随后通过功能富集过滤,权重共表达网络分析,PPI网络分析,以及节点连接度来筛选备用核心基因。最后,我们利用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹验证备用核心基因的表达模式,以便获得理想的抗炎靶点。结果显示:通过DESeq2差异分析,在不同比较组间,我们共获得184个差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,且这些基因与细胞周期和同源重组等代谢通路密切相关。同时,基于PPI蛋白网络,我们共筛选出4个备选核心基因,即BRCA1,ATR,SMC3和BUB1。通过STEM时间序列和WGCNA权重共表达联合分析,我们共获得111个具有相同表达趋势和表达模式的DEGs,且这些基因显着富集于细胞周期和RNA转运等代谢通路。同时,基于WGCNA和PPI网络,我们共筛选出6个备选核心基因,即PNN,SMC3,EIF3A,BUB1,ATR和ORC4。此外,TTK,STAG2和THOC1也与细胞周期密切相关,因此TTK,STAG2和THOC1也作为备选核心基因。至此,共获得10个备选核心基因,即:BRCA1、ORC4、TTK、BUB1、SMC3、ATR、PNN、EIF3A、STAG2和THOC1。基因和蛋白验证结果显示,只有SMC3和BUB1的表达模式与测序结果一致。这些结果表明,SMC3和BUB1可能是万通筋骨片在RA中的抗炎靶点。第四部分基于16S高通量测序和代谢组学联合分析挖掘万通筋骨片在类风湿关节炎中的抗炎靶点基于万通筋骨片对CIA大鼠的抗炎作用,本研究针对CIA大鼠粪便样本和血清样本,分别进行16S高通量测序分析和代谢组学分析,拟挖掘万通筋骨片抗炎作用的肠道菌群靶点和代谢物靶点。16S高通量测序分析:基于操作单元聚类和物种多样性分析,我们拟研究万通筋骨片对肠道菌群结构的影响;基于肠道菌群差异分析,我们拟筛选相对丰度较高的差异菌群。代谢组学分析:基于样本相关性和多元统计分析,我们拟研究万通筋骨片对血清代谢物谱的影响;基于差异代谢物筛选,功能富集过滤和差异代谢物表达分析,我们拟筛选理想的差异代谢物。16S高通量测序与代谢组学联合分析:基于top10差异肠道菌属和top20差异代谢物,我们进行联合分析,拟研究肠道微生物群与血清代谢物的关系,并验证或筛选肠道菌群靶点和代谢物靶点。结果显示:通过16S高通量测序分析,我们发现万通筋骨片可以明显改变CIA大鼠的肠道菌群结构。在门水平上,拟杆菌、软壁菌和脱铁杆菌的菌群相对丰度得到显着改善。此外,拟杆菌与厚壁菌的菌群相对丰度比值（Bacteroidetes/Firmicutes）也恢复到正常水平。在属水平上,弧菌、巨型球菌和漫游球菌的菌群相对丰度下调至正常水平。通过代谢组学分析,我们发现万通筋骨片可以明显改变CIA大鼠的血清代谢物谱。其中,血清素、二硫化谷胱甘肽、N-乙酰神经氨酸、萘和血栓素B2等5种代谢物均有标准化的趋势,但不具有统计学差异。通过16S高通量测序与代谢组学联合分析,我们发现,弧菌、巨型球菌和漫游球菌都存在于top10差异肠道菌群范围内,且与这3种微生物群存在显着联系的代谢物包括5种。此外,考虑到代谢物鉴定过程中的假阳性,我们认为:在这5种代谢物中,只有微管素B是内源性代谢物。这些结果表明,万通筋骨片可能通过调节肠道菌群结构和血清代谢物谱发挥抗炎作用,且弧菌、巨型球菌和漫游球菌可能是万通筋骨片的抗炎靶点菌群;微管素B可能是万通筋骨片的抗炎靶点代谢物。
张津瑞[3]（2021）在《ELP修饰的生物功能材料用于治疗关节炎和软骨缺损的实验研究》文中研究说明背景:类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）、痛风关节炎（Gouty arthritis,GA）和骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是三种常见的无菌性关节炎症,每种疾病都影响着上千万人。RA和GA是由不同原因导致的炎症性关节疾病。在二者的炎症机制中,IL-1β起到了关键的促炎作用。目前以IL-1β为靶点的生物制剂（如人工重组IL-1Ra）虽然表现出了出色的抗炎效果,但其临床应用却受限于半衰期过短、生物利用度低等问题。因此针对上述问题的研究对于RA和GA的治疗具有重要意义。OA以软骨的退变与缺损为主要特点。软骨修复一直是人类医学面临的一个挑战。虽然各种功能性修复材料的出现显着的提升了软骨修复效果,但是组织整合等问题却一直难以解决。据报道提高修复材料的粘附性有望促进软骨组织整合。类弹性蛋白（ELP）具有良好的生物相容性和灵活的结构可修饰性,在药物修饰和粘合剂研发等生物功能材料领域表现出了一定优势,或许可以帮助解决上述问题。本课题基于上述背景进行了下列研究。目的:制备长效IL-1Ra纳米生物制剂以提高其药物半衰期和生物利用度并探究该类药物对于RA和GA的治疗作用;制备新型生物粘合材料并探究其促进软骨修复的治疗作用。方法和结果:1.长效IL-1Ra纳米制剂的制备和表征。构建正电荷修饰的类弹性蛋白（Elastin-like polypeptides,ELP）与IL-1Ra的融合序列并在大肠杆菌中人工表达,成功制备了融合蛋白IL-1Ra-K72;Zeta电位检测显示该蛋白在中性环境中显正电,将其与带负电的羧基聚乙二醇（PEG-COO-）及硫酸软骨素（CS）以非共价组装的方式分别制备了两种纳米药物:IL-1Ra-K72-PEG和IL-1Ra-K72-CS;TEM、DLS、体外缓释检测等结果显示两种纳米颗粒均具有均一的形貌、平均约200nm的水合粒径以及良好的体外缓释能力;与BMSC细胞的共培养发现两种纳米颗粒在0-800μg/mL的浓度范围内均没有表现出明显的细胞毒性。2.IL-1Ra-K72-PEG和IL-1Ra-K72-CS用于治疗大鼠RA的实验研究。首先通过细胞实验验证了药物对IL-1β促炎通路的阻滞作用,发现两种药物对于IL-1β依赖的RPMI1788细胞的增殖具有显着的抑制作用;对于RA-FLS分泌IL-1β下游因子（PGE2和MMP3）的能力也具有明显的抑制作用。IL-1Ra-K72与IL-1Ra的抑制作用没有明显差异,提示融合蛋白与IL-1Ra生物活性水平相当;在成年雌性SD大鼠体内的药代动力学检测发现,IL-1Ra-K72-PEG的血药浓度半衰期为（33.4±2.79）h,IL-1Ra-K72-CS的半衰期为（20.2±2.09）h,而IL-1Ra半衰期只有（6.7±1.86）h。二者的体内生物利用度均达到了IL-1Ra的7倍;在RA大鼠体内试验中,我们通过检测大鼠足爪肿胀程度变化、体内炎症因子（IL-1β、TNF-α、PGE2和MMP3等）水平、组织病理学改变以及免疫组化结果,发现两种纳米药物单次给药就具有优于IL-1Ra 3天/次给药的治疗效果;同时我们发现IL-1Ra-K72-CS治疗组多项指标显着优于IL-1Ra-K72-PEG治疗组。3.利用IL-1Ra-K72-PEG纳米颗粒治疗大鼠GA的实验研究。细胞实验显示IL-1Ra-K72-PEG纳米颗粒对于IL-1β刺激的普通FLS分泌PGE2和MMP3的活动具有显着的抑制作用;在雄性SD大鼠体内的药代结果显示IL-1Ra-PEG的半衰期长达（27.16±2.55）h,是IL-1Ra的4倍;在GA大鼠体内实验中,单次给药治疗72小时后,通过检测大鼠GA踝关节肿胀程度变化、体内IL-1β、TNF-α和IL-6等炎症因子水平以及组织病理切片和免疫组化等方法发现该纳米药物显着抑制了大鼠的GA炎症,且各项结果优于融合蛋白组、IL-1Ra组、吲哚美辛组和PBS对照组。4.超分子组装生物粘合剂的制备及其用于大鼠软骨修复的研究。通过将带正电的K72蛋白与带负电的PEG-COO-和CS共混制备纯生物材料的粘合剂KPC;通过FTIR证明了其内部无化学键形成（非共价组装）;通过SEM观察到其内部结构呈疏松多孔状;在猪皮肤和软骨底片的粘合测试中,KPC的剪切粘合强度可以达到（33.11±2.26）KPa,这一性能优于某些商用纤维蛋白胶水的组织粘合强度;体外累积释放实验证明KPC可以在超过11天的时间持续释放CS;细胞实验显示该粘合剂具有良好的细胞相容性;通过检测II型胶原蛋白和GAG表达量发现该粘合剂具有促进BMSCs成软骨分化的能力,尤其是与TGF-β1协同作用时,显着优于其他单独成分的对照组;将KPC粘合剂植入大鼠股骨滑车部位建立的软骨缺损病灶,八周后观察病灶修复结果、组织切片以及番红O固绿染色结果发现该粘合剂对于软骨缺损具有良好的修复效果,在一定程度上促进了组织整合。结论:1.正电荷ELP蛋白修饰及非共价纳米组装的方式保持了IL-1Ra原有的抗炎活性并提高了药物的半衰期和生物利用度,这种“ELP蛋白修饰+非共价纳米组装”的双重修饰策略可以为其他蛋白药物的研究提供参考;2.长效IL-1Ra纳米制剂可以通过较少的给药次数实现对RA和GA的有效治疗,该药物有望为RA、GA以及其他以IL-1β为主要炎症因子的疾病提供新的候选治疗方案;3.在RA的治疗中,CS可能与IL-1Ra协同抗炎并保护软骨,其具体机制仍需进一步研究;4.超分子组装的生物粘合剂KPC具有优秀的粘合性能,对于医用粘合剂的研究具有一定的参考价值;5.粘附性软骨修复材料可以在一定程度上促进软骨组织整合,并且对于软骨修复具有良好的促进作用,这为后续软骨修复材料的研发和OA的治疗研究提供了参考;6.ELP材料具有良好的生物相容性和灵活的结构可修饰性,其在蛋白药物和生物功能材料的研究中表现出了良好的潜力,在后续相关领域的研究中具有巨大的应用前景。
吴琦[4]（2021）在《类风湿关节炎合并肺间质病变影响因素的研究》文中研究指明目的通过对类风湿关节炎（RA）患者临床病例资料进行回顾性分析,研究类风湿关节炎相关肺间质病变（RA-ILD）发生的影响因素。方法收集2015年1月至2020年7月期间在北京大学深圳医院风湿免疫科住院符合2010年美国风湿病学会（ACR）/欧洲风湿病防治联合会（EULAR）RA分类诊断标准的RA患者病例资料包括基本情况、临床表现、辅助检查等,利用SPSS统计软件进一步分析。结果（1）符合纳入标准的737例RA患者男女比为1:4.12,平均年龄为49.64±14.00岁,平均病程为4.0（1.0,10.0）年。737例RA患者中发生ILD有282例（38.26%）,患者出现第一个RA相关临床症状至发生ILD的中位时间为13年（95%CI 11.33-14.67）,RA患者出现ILD的5年累积发生率为22.70%±1.80%,10年累积发生率为45.40%±2.60%。（2）多因素logistic回归分析显示:高龄（OR1.064,95%CI 1.049-1.079,p=0.000）、男性（OR 1.72,95%CI 1.154-2.565,p=0.008）、吸烟（OR 2.365,95%CI 1.397-4.004,p=0.001）、长病程（OR 1.096,95%CI 1.066-1.128,p=0.000）、高DAS28-ESR（OR 1.271,95%CI 1.021-1.583,p=0.032）、抗CCP抗体升高大于3倍（OR 1.524,95%CI 1.022-2.273,p=0.035）、KL-6>300U/m L（OR 2.570,95%CI 1.093-6.041,p=0.030）、LDL-C升高（OR 1.452,95%CI 1.099-1.918,p=0.009）、CA153升高（OR 1.276,95%CI 1.070-1.522,p=0.007）是RA-ILD的独立危险因素,而HDL-C是RA-ILD的保护因素（OR0.056,95%CI 0.025-0.125,p=0.000）。（3）737例RA患者中血脂异常有298例（40.43%）,其中HDL-C降低有243例、LDL-C升高有47例。相比LDL-C正常的RA患者,LDL-C升高的RA患者ILD（57.45%vs.36.96%,p=0.000）、大动脉硬化（48.94%vs.21.16%,p=0.039）的发生率均较高。相比HDL-C正常的RA患者,HDL-C降低的RA患者ILD（47.33%vs.33.81%,p=0.000）及冠心病（2.88%vs.0.20%,p=0.001）的发生率均较高。（4）HDL-C降低的RA患者出现ILD的中位时间短于HDL-C正常者[10.0（95%CI 9.33-10.67）年vs.17.0（95%CI 14.58-19.42）年,p=0.000]。（5）利用性别、吸烟分层及有无RA-ILD分组分析显示女性RA-ILD组LDL-C水平高于RA-n ILD组（3.01±0.74 mmol/L vs.2.71±0.72mmol/L,p=0.000）,无吸烟的RA-ILD组患者LDL-C水平高于RA-n ILD组（3.00±0.75mmol/L vs.2.73±0.71 mmol/L,p=0.000）,而无论性别及吸烟与否,RA-ILD患者HDL-C水平均低于RA-n ILD。（6）LDL-C水平与KL-6呈正相关,在RA-ILD患者中相关性更强（R2=0.312,p=0.004）。HDL-C水平与DAS28-ESR、hs-CRP呈负相关,在RA-ILD患者中的相关性更强（R2分别为-0.451、-0.247,p均<0.05）。（7）RA-ILD患者的胸部HRCT表现依次为UIP（56.03%）、NSIP（30.85%）、OP（7.09%）、DIP（3.55%）、LIP（2.48%）。HDL-C降低的RA-ILD患者胸部HRCT表现为UIP的比例更高（60.00%vs.53.29%,p=0.002）。（8）与LDL-C正常的RA-ILD者相比,LDL-C升高的RA-ILD者用力肺活量（FVC）下降发生率更高（50.00%vs.21.52%,p=0.015）。与HDL-C正常的RA-ILD者相比,HDL-C降低的RA-ILD患者FVC下降及一氧化碳弥散量（DLCO）发生率均较高（分别为26.92%vs.16.18%,p=0.003;80.76%vs.50.00%,p=0.010）。结论（1）与RA-ILD发生相关的临床独立危险因素有男性、高龄、吸烟、高疾病活动、抗CCP抗体滴度升高、KL-6升高、CA153升高及LDL-C升高,而HDL-C升高是RA-ILD的保护因素。（2）HDL-C降低的RA患者出现ILD的时间较HDL-C正常者早。（3）HDL-C水平与病情活动呈负相关。（4）HDL-C降低的RA-ILD患者胸部HRCT更易表现为UIP型。（5）LDL-C升高的RA-ILD患者更易出现FVC下降。HDL-C降低的RA-ILD患者易出现FVC及DLCO下降。
龚雪[5]（2021）在《基于miR-126调控的VEGF/PI3K/AKT通路研究新风胶囊对类风湿关节炎滑膜血管新生的作用机制》文中认为1目的通过临床研究观察RA患者VEGF、miR-126、凝血指标、血小板参数、细胞因子、相关实验室指标等变化及XFC对其影响;通过实验研究观察AA大鼠关节病理形态、血管内皮细胞超微结构、滑膜MVD、CD34、CD105、细胞因子、miR-126、VEGF/PI3K/AKT信号通路等变化及XFC对其影响,从miR-126调控的PI3K/AKT角度探讨XFC调节RA滑膜血管新生的作用机制。2方法2.1临床研究从安徽省中医院风湿科选取60例RA患者,随机分为XFC组（治疗组）和LEF组（对照组）,每组各30人,另从该院体检中心选取20例健康者为正常对照组。采用全自动凝血仪检测凝血指标,采用全自动血细胞分析检测仪血小板参数,采用生化分析仪检测生化指标,采用荧光定量PCR法测定miR-126、VEGF,采用ELISA检测IL-6、TNF-α,采用魏氏法检测ESR,采用问卷量表记录RA患者生活质量、中医证候积分情况,观察XFC对RA患者的疗效及滑膜血管新生的影响。2.2实验研究将60只大鼠随机分为正常对照组（NC组）、模型组（MC组）、新风胶囊高剂量组（H-XFC组）、新风胶囊中剂量组（M-XFC组）、新风胶囊低剂量组（L-XFC组）,雷公藤多苷片组（TPT组）,每组10只大鼠。除NC组外,向每只大鼠右足跖皮内注射0.1ml FCA致炎,于初次致炎后第13天,再次注射0.05ml FCA增强炎症反应,于第19天开始给药,剂量如下:将XFC去壳研末,加生理盐水制成混悬液（0.3g/ml）,XFC三组分别按照0.5ml/100g（L-XFC组）、1ml/100g（M-XFC组）、2ml/100g（H-XFC组）的剂量灌胃,1次/d;将TGT研成细末,加生理盐水制成混悬液（1mg/ml）,TGT组按1ml/100g的剂量灌胃,1次/d。正常组及模型组予生理盐水灌胃,1ml/100g,1次/d。所有组连续灌胃30天。观察各组大鼠体质量、足跖肿胀度、AI、滑膜病理变化、血管内皮细胞超微结构,采用免疫组织化法检测滑膜MVD、CD34、CD105表达,采用实时荧光定量PCR检测miR-126、VEGF、HIF-1α水平,采用ELISA法测定大鼠滑膜IL-1、HIF-1α、IL-10表达量,采用WB检测PIK3R2、PI3K、AKT、p-AKT、eNOS蛋白表达水平。3结果3.1临床研究结果3.1.1 RA患者凝血指标、血小板参数的变化与正常人相比,60例RA患者外周血D-D、FBG显着升高（P<0.05）,TT、APTT、PT无显着改变（P>0.05）;外周血PLT、PCT、MPV显着升高（P<0.05）,PDW无显着改变（P>0.05）。3.1.2 RA患者细胞因子、实验室指标的变化与正常人相比,60例RA患者外周血IL-6、TNF-α显着升高（P<0.05）;外周血CRP、ESR、RF、CCP、Ig G水平显着升高（P<0.05）,Ig A、Ig M、C3、C4无显着改变（P>0.05）。3.1.3 RA患者血清VEGF、血浆miR-126水平的变化与正常人相比,60例RA患者血清VEGF、血浆miR-126水平显着升高（P<0.05）。3.1.4 RA患者血清VEGF与各指标相关性分析RA患者VEGF与凝血指标D-D、FBG、APTT、PT呈正相关（P<0.05）,与TT无相关性（P>0.05）;与血小板参数PLT、PCT、MPV呈正相关（P<0.05）,与PDW无相关性（P>0.05）;与细胞因子IL-6、TNF-α呈正相关（P<0.05）;与实验室指标CRP、ESR、CCP、Ig G呈正相关（P<0.05）,与RF、Ig A、Ig M、C3、C4无相关性（P>0.05）;与miR-126呈正相关（P<0.05）。3.1.5 RA患者血清VEGF与中医证候及生活质量的相关性分析RA患者VEGF与关节疼痛、关节肿胀、关节压痛呈正相关（P<0.05）,与夜间疼痛加重、晨僵无相关性（P>0.05）;与食欲减退、倦怠乏力、食后腹胀、大便稀溏呈正相关（P<0.05）,与少气懒言、关节重着无相关性（P>0.05）;与关节刺痛、唇色、肌肤甲错呈正相关（P<0.05）,与舌质呈负相关（P<0.05）,与脉象、皮下瘀斑无相关性（P>0.05）。RA患者VEGF与AQT、生理功能、社会功能、健康自我认识能力呈正相关（P<0.05）,与心理功能无相关性（P>0.05）。3.1.6 XFC治疗RA的临床疗效治疗后XFC组显效率为63.3%,LEF组为43.3%;XFC组有效率为26.7%,LEF组为40%;XFC组总有效率为90%,LEF组为83.3%。由此可见,XFC组显效率高于LEF组（P<0.05）,总有效率相当（P>0.05）。3.1.7 XFC对RA患者凝血指标、血小板参数的影响与治疗前相比,两组治疗后凝血指标D-D、FBG和血小板参数PLT明显降低（P<0.05）,凝血指标APTT、PT、TT和血小板参数PCT、MPV、PDW无明显改变（P>0.05）;与LEF组治疗后相比,XFC组治疗后凝血指标D-D和血小板参数PLT降低更明显（P<0.05）。3.1.8 XFC对RA患者细胞因子及实验室指标的影响与治疗前相比,两组治疗后细胞因子IL-6、TNF-α和实验室指标CRP、ESR、RF、CCP、Ig G明显降低（P<0.05）;与LEF组治疗后相比,XFC组治疗后细胞因子IL-6、TNF-α和实验室指标CRP、ESR、CCP降低更明显（P<0.05）。3.1.9 XFC对RA患者miR-126、VEGF的影响与治疗前相比,两组治疗后miR-126、VEGF水平降低（P<0.05）;与LEF组治疗后相比,XFC组治疗后miR-126、VEGF水平下降更明显（P<0.05）。3.1.10 XFC对RA患者中医证候积分、生活质量评分的影响与治疗前相比,两组治疗后主要关节症状、脾虚证候、血瘀证候各指标均明显改善（P<0.05）;与LEF组治疗后相比,XFC组治疗后关节疼痛、关节压痛、食欲减退、食后腹胀、大便稀溏、关节刺痛、唇色、肌肤甲错改善更明显（P<0.05）。与治疗前相比,两组治疗后生活质量各指标均明显改善（P<0.05）;与LEF组治疗后相比较,XFC组生活质量各指标改善更明显。3.2实验研究结果3.2.1 AA大鼠体质量、足趾肿胀度和AI变化及XFC对其影响造模前各组大鼠体质量、足跖肿胀度、AI无明显差异（P>0.05）。造模后,除NC组大鼠,其余各组大鼠右后足趾皮肤渐出现红肿、紧绷、灼热,致炎后第2-3天肿胀明显,第6-7天部分致炎趾局部出现溃烂,第8-10天肿胀度有所缓解,局部皮温基本恢复正常,第13-14天前后,足趾再次出现肿胀,部分大鼠对侧足趾出现肿胀。给药前,MC组、各治疗组大鼠足趾肿胀度和AI均显着高于NC组（P<0.05）,体质量均显着低于NC组（P<0.05）,MC组与各治疗组之间无显着差异（P>0.05）。给药30天后,与NC组比较,MC组大鼠足趾肿胀度和AI升高（P<0.05）,体质量明显降低（P<0.05）;与MC组比较,各治疗组大鼠足跖肿胀度和AI明显降低（P<0.05）,体质量明显增高（P<0.05）;XFC高、中、低剂量三组相比,M-XFC组足跖肿胀度和AI明显降低（P<0.05）,M-XFC组体质量显着高于H-XFC组,与L-XFC组无明显差异（P>0.05）;与M-XFC组比较,TPT组AI较高（P<0.05）,体质量和足跖肿胀度无明显差异（P>0.05）。3.2.2 AA大鼠关节病理形态学变化及XFC对其影响光镜下可见NC组大鼠关节滑膜组织结构完整,滑膜无增生,无炎细胞浸润,单层细胞。与NC组相比,MC组关节滑膜增生,血管增多,滑膜呈绒毛状突起至关节腔内,有大量炎性细胞浸润,滑膜衬细胞增厚、多层。药物干预后,M-XFC组滑膜结构恢复的最好,滑膜分层、增生明显改善,炎性细胞减少,关节面较规整。与M-XFC组相比,H-XFC组、L-XFC组滑膜及其周围组织炎性细胞浸润,增生血管多,滑膜衬细胞增厚,分层明显,关节面欠规整;TPT组滑膜细胞增厚,有分层,关节面欠规整。3.2.3 AA大鼠血管内皮细胞超微结构的变化及XFC对其影响电镜下可见NC组血管内皮细胞线粒体基本无变形、肿胀,粗面内质网丰富,核膜边界清楚,染色质分布均匀,嵴突排列规整。MC组内皮细胞变形,线粒体空泡化较多,粗面内质网减少、破坏,核膜边界不清,嵴突排列不规整、部分消失。药物干预后,M-XFC组内皮细胞线粒体少量呈变形,粗面内质网较多,核膜边界较清楚,染色质较均匀,大部分嵴突排列完整。H-XFC组内皮细胞线粒体减少,粗面内质网明显减少,大部分嵴突消失。L-XFC组内皮细胞线粒体轻微肿胀、变形,胞浆水肿,粗面内质网略减少且扩张明显,嵴突排列较紊乱。TPT组内皮细胞线粒体轻微肿胀,嵴突部分破坏,粗面内质网可见且中度扩张,胞浆轻度水肿。3.2.4 AA大鼠滑膜微血管密度、CD34、CD105变化及XFC对其影响给药30天后,与NC组比较,MC组大鼠滑膜MVD、CD34、CD105显着升高（P<0.05）。与MC组比较,各治疗组MVD、CD34、CD105显着降低（P<0.05）。XFC高、中、低剂量三组相比,M-XFC组MVD、CD34、CD105降低更明显（P<0.05）。与M-XFC组比较,TPT组MVD、CD34、CD105无显着差异（P>0.05）。3.2.5 AA大鼠细胞因子变化及XFC对其的影响给药30天后,与NC组比较,MC组细胞因子IL-1、TNF-α显着升高,IL-10显着降低（P<0.05）。与MC组比较,各治疗组IL-1、TNF-α显着降低,IL-10显着升高（P<0.05）。XFC高、中、低剂量三组相比,M-XFC组IL-1、TNF-α显着降低,IL-10显着升高（P<0.05）。与M-XFC组比较,TPT组TNF-α显着升高（P<0.05）,IL-10、IL-1无明显差异（P>0.05）。3.2.6 AA大鼠滑膜miR-126、HIF-1α变化及XFC对其影响给药30天后,与NC组比较,MC组滑膜HIF-1α、miR-126水平显着升高（P<0.05）。与MC组比较,各治疗组滑膜HIF-1α、miR-126水平显着降低（P<0.05）。XFC高、中、低剂量三组相比,M-XFC组滑膜HIF-1α、miR-126水平显着降低（P<0.05）。与M-XFC组比较,TPT组滑膜HIF-1α水平显着升高（P<0.05）,miR-126水平无显着差异（P>0.05）。3.2.7 AA大鼠滑膜VEGF/PI3K/AKT信号通路变化及XFC对其影响给药30天后,与NC组比较,MC组滑膜VEGF水平、蛋白PI3K、AKT、p-AKT、eNOS表达显着升高（P<0.05）,蛋白PIK3R2表达显着降低（P<0.05）。与MC组比较,各治疗组滑膜VEGF水平、蛋白PI3K、AKT、p-AKT、eNOS表达显着降低（P<0.05）,蛋白PIK3R2表达显着升高（P<0.05）。各治疗组相比,M-XFC组滑膜VEGF水平显着降低（P<0.05）;M-XFC组蛋白PI3K、AKT、p-AKT、eNOS表达显着低于L-XFC组（P<0.05）,与H-XFC组和TPT组无明显差异（P>0.05）;M-XFC组蛋白PIK3R2表达显着高于L-XFC组（P<0.05）,与H-XFC组和TPT组无明显差异（P>0.05）。4结论4.1 XFC对RA患者的临床疗效及对血管新生的影响XFC能显着控制RA患者炎症反应与病情活动,调节患者血管环境,改善关节症状与整体生活质量;XFC能显着降低RA患者血浆miR-126和血清VEGF水平,调控血管生长因子水平,抑制血管新生。4.2 XFC对AA大鼠关节症状及滑膜血管新生的影响XFC能改善AA大鼠血管内皮细胞及滑膜结构,改善滑膜病理形态变化;调节细胞因子水平,控制关节滑膜炎症反应;改善关节形态与功能,调节大鼠整体生长状态;XFC能显着下调AA大鼠滑膜miR-126表达,促进PIK3R2分泌,降低VEGF水平,抑制PI3K/AKT信号通路活性。4.3 XFC对滑膜血管新生的作用机制XFC能平衡细胞因子网络,减少炎症对滑膜的刺激;改善血管内皮细胞及滑膜结构,缓解血管内皮细胞功能损害,减轻滑膜形态病理改变;调节血管环境,减少滑膜病变;调节HIF-1α分泌,减少应激反应,抑制滑膜微血管应激性增殖;调节miR-126调控的VEGF/PI3K/AKT通路的表达,通过下调miR-126表达,促进PIK3R2表达,抑制VEGF分泌,减少PI3K、AKT分泌,下调PI3K/AKT信号通路活性,减少血管新生。
韩大飞[6]（2021）在《MicroRNA-10b通过干扰CD4+T细胞亚型平衡促进关节炎的发展》文中指出类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种全身系统性的自身免疫性疾病,其主要的病理特征为滑膜增生、血管翳形成、软骨和骨骼的进行性破坏、新生血管生成以及活化的炎性白细胞（如Th1淋巴细胞和单核细胞）浸润关节滑膜。许多研究表明,各种类型的免疫细胞（例如CD4+Th细胞、巨噬细胞及B细胞）参与了RA的发生与发展。然而,其潜在发病机制机制非常复杂,不仅涉及遗传和环境因素,而且涉及多种细胞之间相互作用,导致目前RA发病的免疫机制尚不十分清楚。CD4+T细胞可显着增强其他细胞（如CD8+T细胞和NK细胞）的效应功能,以消除病原体,但是其过度活化却加速了RA的发病过程。CD4+T细胞在侵袭滑膜组织的炎症细胞中占大部分,并参与了RA病理过程。通过T细胞受体和共刺激分子与各种先天性免疫细胞产生的细胞因子相互作用,幼稚的CD4+T细胞能够分化为功能不同的Th细胞,例如Th1、Th2、Th17、滤泡性Th（Tfh）和调节性T（Treg）细胞。Th1和Th17细胞促进滑膜炎症和破骨细胞形成,最终导致关节破坏,而Th2和Treg细胞改善关节炎的进展。微小RNA（MicroRNA,miRNA）是长度大约22个核苷酸的单链RNA,主要通过选择性结合靶基因的3’-非翻译区（3’-UTR）的特定位点来抑制蛋白翻译和降解m RNA。据估计,所有m RNA中约60%处于miRNA的控制之下,有些被认为是控制单个或多个细胞途径的主要调控因子。有研究发现微小RNA-10b-5p（MicroRNA-10b-5p,miR-10b）可以通过调节T细胞分化,从而参与炎症相关疾病。但是之前的研究缺乏基因敲除关节炎小鼠模型及体内模型关键治疗证据,因而导致miR-10b在RA发病过程中具体功能和机制不明确。本研究拟首先检测miR-10b在RA患者体内的表达水平和定位,其次利用miR-10b基因敲除小鼠建立胶原抗体诱导性关节炎（Collagen antibody-induced arthritis,CAIA）模型,评价miR-10b在关节炎中的作用,再利用RNA测序和生物信息学预测的方法筛选miR-10b的靶点并体外验证miR-10b及其下游靶基因的功能,最后利用胶原诱导性关节炎（Collagen-induced arthritis,CIA）模型,尾静脉给予miR-10b抑制剂,在体内水平评估miR-10b抑制剂的治疗作用。目的:研究miR-10b在RA发病过程中的作用,为RA等自身免疫性疾病的临床治疗提供新的诊疗思路。明确miR-10b在RA患者体内的表达情况,以及miR-10b在体内和体外的生物学功能,阐明miR-10b发挥生物学功能的具体机制,明确其在RA发病过程中扮演的角色,从而为缓解RA等依赖CD4+T细胞调节的自身免疫性疾病提供实验依据。方法:1.利用实时荧光定量PCR和原位杂交技术检测miR-10b在RA患者PBMC和滑膜组织中的表达情况。2.利用5-克隆胶原抗体联合LPS建立miR-10b基因敲除小鼠CAIA模型。记录各组小鼠整体指标（足爪肿胀数、关节炎指数等）变化情况。利用HE染色和番红-O固绿染色评价小鼠膝关节病理变化情况。3.利用RNA转录组测序技术,筛选miR-10b基因敲除与野生型小鼠CAIA模型滑膜和PBMC中的差异基因,并将差异基因进行信号通路分析。利用流式细胞术分选出健康人PBMC和小鼠脾脏CD4+T细胞,分别转染miR-10b的模拟物和抑制剂,转染培养后使用流式细胞术检测CD4+T细胞各亚群的比例变化情况。4.利用miRNA靶基因预测网站并结合miR-10b的功能,预测miR-10b的可能靶点。利用双荧光素酶报告基因技术证明miR-10b与其靶点的直接结合作用,并用免疫印迹法证明miR-10b对其靶点调控作用。利用免疫组化方法检测GATA3和PTEN在RA患者滑膜组织、miR-10b基因敲除和野生型小鼠CAIA模型内表达情况。5.设计miR-10b靶基因的siRNA序列,并使用免疫印迹法筛选敲低效率最优的siRNA序列。将siRNA序列转染到CD4+T细胞中,转染培养后,流式细胞术检测CD4+T细胞各亚群的比例变化情况。6.利用鸡Ⅱ型胶原建立小鼠CIA模型,随机分为正常组、CIA模型组、抑制剂对照组和miR-10b抑制剂组。分别尾静脉注射miR-10b抑制剂、抑制剂序列的对照序列和生理盐水,治疗四周后观察各组小鼠整体指标（关节炎指数、关节肿胀数、足掌厚度、体重等）变化情况,胸腺和脾脏指数变化情况,利用HE染色和番红-O固绿染色评价小鼠膝关节和脾脏病理变化情况。利用X-射线技术,检测CIA软骨磨损和关节畸形的变化情况。利用超声技术,检测膝关节滑膜病理改变和血流信号变化情况。利用免疫组化技术,检测CIA小鼠膝关节内CD4、GATA3和PTEN表达情况,检测脾脏内CD4表达情况。7.流式细胞术检测CIA小鼠PBMC和脾脏内CD4+T细胞各亚群的比例变化情况。结果:1.miR-10b在RA患者体内表达情况RT-q PCR结果显示,与健康对照相比,miR-10b在RA患者PBMC中高表达。FISH结果提示,与健康对照相比,miR-10b在RA滑膜组织中高表达,并且miR-10b主要分布于新生血管部位。2.miR-10b基因敲除对CAIA模型的影响结果显示,miR-10b敲除明显降低CAIA模型小鼠关节炎指数和指关节肿胀数。HE和番红-O固绿染色结果显示,miR-10b敲除明显减少CAIA模型小鼠炎性细胞浸润、血管翳形成、滑膜增厚、炎症、骨和软骨破坏等病理变化情况。3.miR-10b促进CAIA关节炎模型发生与发展的作用机制RNA测序及KEGG信号通路分析结果提示,miR-10b敲除组和野生组的小鼠CAIA模型中,异常表达的基因主要参与调节CD4+T细胞亚群分化。流式细胞术结果提示,miR-10b的模拟物可升高IFN-γ和IL-17A的水平,降低IL-4和Foxp3的水平,而miR-10b的抑制剂则可产生与之相反的作用。4.miR-10b调节CD4+T细胞亚群分化的作用机制生物信息学预测结果显示,miR-10b可能靶向GATA3和PTEN。双荧光素酶报告基因结果显示,miR-10b可直接结合GATA3和PTEN的3’非编码区。免疫印迹结果显示,miR-10b可抑制GATA3和PTEN蛋白表达。免疫组化结果显示,与健康人的滑膜组织相比,GATA3和PTEN在RA病人的滑膜组织中表达量较低,且未出现在血管和淋巴管位置。另外,与野生型组相比,GATA3和PTEN在miR-10b基因敲除小鼠膝关节滑膜组织中高表达,而在miR-10b野生型中表达量较低。5.GATA3和PTEN siRNA对CD4+T细胞亚群分化的影响根据免疫印迹的结果选出siRNA敲低效率最优的siRNA序列将最优序列转染到人和小鼠CD4+T细胞后,流式细胞术结果显示,GATA3 siRNA可升高IFN-γ水平,而降低IL-4水平,PTEN siRNA可升高IL-17A水平,而降低Foxp3水平。6.miR-10b抑制剂对小鼠CIA模型的治疗作用miR-10b抑制剂可恢复CIA小鼠体重,显着降低CIA模型关节炎指数和关节肿胀数,降低CIA小鼠足爪厚度,改善CIA小鼠膝关节和脾脏的病理改变。X-射线结果显示,miR-10b抑制剂可减少CIA小鼠膝关节磨损、软骨破坏和指关节弯曲变形现象情况。miR-10b抑制剂可明显降低CIA小鼠脾脏指数和胸腺指数,并显着减少CIA小鼠膝关节和脾脏浸润的CD4+T细胞,升高CIA小鼠滑膜组织内GATA3和PTEN的表达。超声结果显示,miR-10b抑制剂可显着减少膝关节滑膜组织和血流信号的改变。流式细胞术结果提示,miR-10b抑制可显着降低IFN-γ和IL-17A水平,显着升高IL-4和Foxp3水平。结论:1.miR-10b在RA患者中高表达。miR-10b在RA患者PBMC和滑膜组织内表达水平较高,并且主要分布于新生血管部位。提示miR-10b可能参与RA的发病过程,并且可能主要在外周血来源的免疫细胞中发挥作用。2.miR-10b基因敲除减弱CAIA模型的严重程度。miR-10b基因敲除明显降低CAIA模型整体指标变化和膝关节病理变化,缓解CAIA模型的发生与发展。miR-10b在CAIA模型中扮演致炎角色,加速关节炎的发病过程。3.miR-10b参与调节CD4+T细胞亚群分化。miR-10b促进人源和小鼠Th1/Th17细胞分化,同时抑制Th2/Treg细胞分化。这说明RA患者体内高表达的miR-10b导致CD4+T细胞亚群比例失衡,从加速关节炎的发生与发展。4.miR-10b导致CD4+T细胞亚群比例失衡的原因是其直接靶向结合GATA3和PTEN的3’非编码区,降低GATA3和PTEN的蛋白的表达,从而影响了CD4+T细胞亚型的分化。5.miR-10b抑制剂对CIA小鼠具有治疗作用。miR-10b抑制剂缓解CIA模型整体指标及病理改变,并可平衡CIA模型小鼠CD4+T细胞的4个亚群比例。本研究为RA的治疗提供了新思路及实验基础。
敖丽梅[7]（2020）在《蒙药三子汤为基础的系列方剂对CIA大鼠关节新生血管的影响》文中研究表明目的1.观察蒙药三子汤对胶原诱导性关节炎（Collagen-induced arthritis,CIA）模型大鼠关节炎症的影响,比较三子汤、森登4汤、忠伦5汤缓解炎症的作用差异。2.明确三子汤为基础的系列方剂对CIA模型大鼠关节新生血管形成的作用和潜在机制,分析森登4汤、忠伦5汤与三子汤相比是否具有增效作用或其他作用机制差异。3.观察三子汤为基础的系列方剂含药血清对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-like synoviocytes,FLS）和人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）增殖的影响以及对HUVEC管腔形成的影响。方法实验一:以CIA大鼠为研究对象,通过对其体重、关节肿胀度、关节炎评分、关节病理改变和炎性因子白介素（Interleukin,IL）-1β、干扰素（Interferon,IFN）-γ水平的评估,观察三子汤、森登4汤、忠伦5汤的不同剂量改善CIA滑膜炎症的作用,筛选出最佳剂量,比较三种复方的药效差异。对120只雄性SD大鼠随机分组:正常对照组（n=10）、造模组（n=110）,对造模组构建CIA模型;模型建立完成后,对大鼠随机分组如下:模型对照组,雷公藤多苷片组（0.02g/kg/d）,三子汤低、中、高剂量组（1.35g/kg/d,2.7g/kg/d,5.4g/kg/d）,森登 4 汤低、中、高剂量组（1.35g/kg/d,2.7g/kg/d,5.4g/kg/d）和忠伦 5汤低、中、高剂量组（1.35g/kg/d,2.7g/kg/d,5.4g/kg/d）,各组6只,对正常对照组和模型对照组灌胃蒸馏水;在初次接受免疫后的第21天,对大鼠口服灌胃给药,持续4周,每日一次;分别在致炎前、给药前、给药1周、2周、3周和4周后,观察记录各组大鼠的一般状态、体重、足爪厚度,对关节炎指数进行评分;灌胃给药前实施大鼠目内眦取血,酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay,Elisa）法检测抗二型胶原（Collagen typeⅡ,CⅡ）抗体含量;给药4周结束后取材,采用苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin,HE）染色对CIA大鼠踝关节的病理改变进行观察,采用免疫组化法对大鼠踝关节中的炎性因子IL-1β、IFN-γ的表达情况进行检测。实验二:明确三种复方改善CIA大鼠滑膜新生血管的作用和潜在的机制,筛选最佳剂量,比较三种复方的作用差异。延续实验一,取材结束后Elisa法检测CIA大鼠外周血清中血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、内皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric-oxide synthase,eNOS）、组织纤溶酶原激活物（Tissue plasminogen activator,tPA）含量;运用免疫组化法检测CIA大鼠踝关节中VEGFA、胎盘生长因子（Placental growth factor,PLGF）、缺氧诱导因子（Hypoxia inducible factor,HIF）-α的表达情况;蛋白质印迹法（Western blot,WB）检测大鼠踝关节中血管生成素（Angiopoietin,Ang）-1、Ang-2、酪氨酸激酶受体（Tyrosine kinase receptor,Tie）-2蛋白的表达。实验三:通过运用血清药理学方法观察三种复方不同浓度的含药血清在体外实验中对RA-FLS和HUVEC增殖的作用以及对HUVEC管腔形成的影响,筛选出最佳浓度,比较三种复方之间差异,并结合检测血管生成相关的细胞因子,初步探讨三种复方对RA-FLS和HUVEC增殖的作用机制。制备三种复方的含药血清,分别建立以IL-1 β诱导的RA-FLS损伤模型和以VEGF165诱导的HUVEC损伤模型,MTT法检测三种复方不同浓度（5%、10%、20%）的含药血清对两种体外细胞损伤模型的细胞活力;观察三种复方含药血清对HUVEC管腔形成的影响;Elisa法检测RA-FLS细胞上清中VEGF、PLGF、Ang-1、Ang-2的含量及HUVEC细胞上清中血管内皮生长因子受体（Vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR）-1、VEGFR-2、Tie-2 的含量。结果实验一:与正常对照组相比,模型对照组大鼠血清抗CⅡ抗体含量显着增高（P<0.01）,提示CIA模型建立成功。与模型对照组相比,三子汤和忠伦5汤高剂量可明显增加大鼠体重（P<0.05）;森登4汤和忠伦5汤的高剂量能明显缓解CIA大鼠关节肿胀的程度（P<0.05）;三子汤中、高剂量,森登4汤低、中、高剂量和忠伦5汤高剂量都能明显降低CIA大鼠关节炎症评分（P<0.05）;三种复方的高剂量都可以明显缓解CIA大鼠踝关节炎症及减轻新生血管的生成（P<0.05）;森登4汤和忠伦5汤的高剂量对降低大鼠踝关节中IL-1β、IFN-γ表达具有明显作用（P<0.05）,而三子汤没有明显作用（P>0.05）。实验二:Elisa结果显示,与模型对照组相比,三子汤、森登4汤的高剂量和忠伦5汤中、高剂量可以明显降低大鼠血清中VEGF含量（P<0.05）;各给药组大鼠外周血清中eNOS含量均明显降低（P<0.05）,以三子汤、森登4汤的高剂量和忠伦5汤中剂量效果最佳;忠伦5汤中、高剂量组大鼠外周血清中tPA含量均明显降低（P<0.05）。免疫组化方法结果显示,与模型对照组相比,森登4汤、忠伦5汤的高剂量组大鼠踝关节中VEGFA的表达明显降低（P<0.01）;雷公藤多苷片组,三子汤、森登4汤和忠伦5汤的中、高剂量组大鼠踝关节中PLGF表达均呈降低趋势,但没有统计学意义（P<0.05）;森登4汤和忠伦5汤高剂量组大鼠踝关节中的HIF-α表达明显降低（P<0.05）。WB检测结果显示,与模型对照组相比,三子汤、忠伦5汤的高剂量和森登4汤的中、高剂量有下调大鼠踝关节中的Ang-1蛋白表达的趋势,但无统计学意义（P<0.05）;三种复方的各给药剂量都能降低大鼠踝关节中Ang-2蛋白的表达（P<0.05）;三子汤、森登4汤的中剂量能降低大鼠踝关节中Tie-2蛋白的表达（P<0.05）。实验三:MTT结果显示,与IL-1 β诱导组相比,三种复方含药血清在抑制RA-FLS增殖方面均有显着作用（P<0.05）,最佳浓度都是20%;与VEGF165诱导组相比,三种复方含药血清均能抑制HUVEC的增殖（P＜0.05）,以20%浓度的三子汤、10%和20%的忠伦5汤含药血清的效果最显着;两种细胞得出各组含药血清疗效的最佳作用时间均为24小时。HUVEC管腔形成实验结果显示三种复方20%浓度组的含药血清都有减少VEGF165诱导的HUVEC的管腔形成的趋势,但无统计学意义（P>0.05）。Elisa检测结果显示,与IL-1β诱导组相比,10%、20%的三子汤、森登4汤和忠伦5汤含药血清组作用下的VEGF含量均明显降低（P＜0.01）;各浓度组的三子汤、森登4汤和忠伦5汤含药血清均能有效降低PLGF、Ang-1的含量（P<0.01）;20%的三子汤、10%、20%的森登4汤和忠伦5汤含药血清均能明显降低Ang-2的含量（P<0.05）。与VEGF165诱导组相比,三种复方含药血清的各个浓度都能降低VEGFR-1的含量（P<0.01）;10%、20%三子汤以及5%、10%、20%的森登4汤和忠伦5汤含药血清能降低VEGFR-2的含量（P<0.01）;10%、20%的三种复方含药血清能降低Tie-2的含量（P<0.05）;各细胞因子有效药物的最佳浓度均为20%。结论森登4汤和忠伦5汤与基础方三子汤相比,在缓解CIA大鼠关节炎症方面具有一定的增效作用,但两者之间没有显着差异。三种复方都能通过调控参与HIF-VEGF-Ang轴中的关键细胞因子来发挥缓解CIA关节新生血管的作用,但发挥药效作用机制各有偏重,三子汤主要通过降低血管生成刺激因子VEGF、eNOS的表达、抑制Ang-2/Tie-2途径发挥作用;森登4汤通过VEGF、HIF-α、eNOS的表达、抑制Ang-2/Tie-2途径发挥作用;忠伦5汤通过下调VEGF、HIF-α、eNOS和Ang-2的表达发挥作用;森登4汤的作用靶点更多,在抗血管新生方面可能更具优势。为三子汤为基础的系列方剂治疗类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）和进一步研究蒙药优化组方、新药研发提供了科学依据。
许冰馨[8]（2020）在《地塞米松及其温敏凝胶制剂对CIA大鼠的治疗机制研究》文中进行了进一步梳理研究目的:研究并探讨地塞米松（DEX）及其温敏凝胶制剂（DLTH）对胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠具体的药理学作用机制。研究内容:通过在Wistar大鼠上建立CIA模型,采用不同的给药途径、频率与剂型:（1）腹腔注射地塞米松溶液、（2）膝关节腔注射地塞米松温敏凝胶缓释制剂,观察DEX对CIA大鼠炎症消除、疼痛缓解以及整体免疫功能的改善作用。研究方法:（1）雄性Wistar大鼠随机分为3组:正常组、模型组、DEX组。建立CIA模型。于造模完成隔日,给药组开始给予DEX（1mg/kg）腹腔注射,一周注射3次,连续4周。（2）雄性Wistar大鼠经过随机分组（正常组、模型组、DLTH组）,建立CIA模型。待大鼠足趾肿胀后,给药组开始给予DLTH（1mg/kg）双侧膝关节腔注射,每个关节注射40μl,一周注射2次,连续3周。实验期间,记录大鼠体重、足爪容积、关节评分,测量机械性缩足反射阈值（MWT）和压力痛阈值（PPT）。最后获取血清、脾脏、滑膜、软骨、L4-L6双侧背根神经节（DRG）、膝关节。检测血清中细胞因子,滑膜中炎症因子和NF-κB通路关键蛋白水平变化,软骨中金属蛋白酶水平以及软骨免疫组化,结合膝关节病理和足爪红肿治疗情况来研究药物对炎症的影响。对比模型组和给药组DRG中炎症因子、神经因子、离子通道和血清中前列腺素水平改变,结合机械痛阈变化趋势,来探讨药物对缓解疼痛的机制。比较模型组和给药组免疫器官指数,检测脾脏淋巴细胞中炎症因子、转录因子水平、Th1/Th2,Th17/Treg比值,验证药物对CIA模型的免疫调节的作用。HPLC法检测血药浓度,并比较血药浓度和脏器系数、T细胞亚群特异性转录因子水平的相关性。研究结果:1地塞米松溶液（DEX）腹腔注射,通过降低大鼠滑膜组织中的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17,调节血清中的细胞因子水平,降低软骨中MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5来抑制滑膜炎症、软骨降解、改善机体抗炎状态。其次通过抑制DRG中炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17）,疼痛相关离子通道受体TRPV1和神经生长相关因子NGF、NPY、BDNF的水平,来提高CIA大鼠的疼痛阈值、减少机械痛敏、减轻疼痛。免疫方面,通过降低脾脏淋巴细胞中的炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17）、改善Th1,Th2,Th17和Treg的特异性转录因子T-bet,GATA3,RORγT,Foxp3水平、调节机体中Th1/Th2、Th17/Treg的比例,来改善脾脏免疫应答。2 DLTH膝关节腔注射可以降低滑膜组织中炎症因子、神经生长因子,抑制滑膜组织中NF-κB通路活化、改善膝关节滑膜、血管、软骨的炎性病理状态、降低CIA大鼠足爪容积和关节评分、消除足爪红肿变形,缓解关节局部炎症。疼痛方面:通过抑制背根神经节中IL-6、TNF-α、神经生长因子NPY,NGF,BDNF,改善离子通道TRPV1,Nav1.3,Nav1.7水平,降低血清中前列腺素PGE2、PGI2,提升抑炎的PGD2含量,减少滑膜中炎症因子和NGF表达,降低大鼠MWT和PPT痛阈值、抑制疼痛。DLTH还可以降低脾脏、胸腺肿大,改善整体免疫机能。研究结论:1 DEX腹腔注射可以改善CIA大鼠整体炎症状态、减少滑膜炎性浸润和软骨破坏,抑制疼痛,改善整体免疫失衡状态。2 DLTH膝关节注射可以改善CIA滑膜增生、减少血清、DRG和滑膜中疼痛相关因子从而缓解疼痛,并降低了免疫器官的脏器指数。DLTH较DEX可以降低给药频次。
贾琼[9]（2020）在《TNFTNF-α/TGF/TGF-β1信号轴调控半月板损伤后软骨下骨的研究》文中提出目的:半月板损伤导致的骨关节炎是常见外伤性疾病之一,国内外医学界对其防治是比较困难的。本课题通过动物模型研究半月板损伤后骨关节炎中软骨下骨的组织病理和影像学表现,以及与血清中的TNF-α和TGF-β1水平之间的相关性,一是探究半月板损伤后骨关节炎中软骨下骨的组织病理学表现TNF-α/TGF-β1信号轴的内在联系,试图用中医的阴阳平衡理论来解释其发病机制,旨在从中西医结合理论的角度阐释半月板损伤后骨关节炎中软骨下骨的变化机制;二是论述这两种细胞因子组成TNF-α/TGF-β1信号轴在该疾病发展中的作用以及反映该疾病组织结构病理学变化的可靠性,为将来临床诊疗方案的制定提供指导和借鉴工具。方法:临床部分:通过收集OA患者行全膝关节置换术后遗弃的胫骨平台组织,大体观察后,区分硬化与非硬化区,通过Micro-CT检测并比较骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数目（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁间隔（Tb.Sp）,计量资料以均值±标准差（Mean±SD）表示;实验部分:通过建立半月板损伤骨关节炎大鼠模型（MMT）,取8周龄健康SD大鼠90只,正常雄性,无关节病变。随机分为三组,手术组、空白对照组、假手术组各30只。分别于MMT术后第2、4、8和12周进行检测相关指标。研究观察软骨下骨板的形态结构和组织骨密度（TMD）,研究MMT术后不同时间与内侧平台骨小梁体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁数目（Tb.N）关系。采用共聚焦拉曼光谱分析软骨下骨的胶原矿质比（Proline/PO43-）,采用原位纳米压痕仪评估软骨下骨内在的弹性模量（Er）和硬度（H）。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中TNF-α和TGF-β 1表达水平。结果:临床部分:内外侧平台比较中,两组BV/TV 比较为（t=8.335,P=0.024<0.05）;两组 Tb.Th 比较为（t=12.707,P=0.001<0.05）,两组 Tb.Sp 比较为（t=21.026,P=0.029<0.05）;两组Tb.N 比较为（t=5.293,P=0.02<0.05）均提示有差异。两组相比,TGF-β 1差异有统计学意义（t=13.28,P=0.032<0.05）;两组相比,TNF-α差异有统计学意义（t=39.10,P=0.017<0.05）;提示观察组与健康组之间外周血TGF-β 1和TNF-α有差异。实验部分:检测软骨下骨的形态结构和组织骨密度（TMD）,内侧平台骨小梁体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）,骨小梁数目（Tb.N）,软骨下骨的矿质/胶原比（Proline/PO43-）,软骨下骨内在的弹性模量（Er）和硬度（H）等,以及血清中TNF-α和TGF-β 1表达水平。结果显示:①其中与假手术组、空白对照组相比:手术组（MMT组）的第 2 周（F=58.552,P=0.000<0.01）4 周（F=85.669,P=0.000<0.01）、8周（F=14.729,P=0.000<0.01）、12 周（F=95.961,P=0.000<0.01）的骨体积分数（BV/TV）均有显着差异（P<0.01）;②手术组（MMT组）在第2周的组织骨密度（TMD）均有差异（F=15.795,P=0.000<0.01）,4 周（F=23.626,P=0.000<0.01）、8 周（F=41.197,P=0.000<0.01）、12 周（F=263.033,P=0.000<0.01）的组织骨密度（TMD）均有显着的差异（P<0.01）;③手术组（MMT组）的第2周（F=70.122,P=0.000<0.01）、4 周（F=60.799,P=0.000<0.01）、8 周（F=825.365,P=0.000<0.01）、12周（F=1813.386,P=0.000<0.01）的骨小梁间隙（Tb.Sp）均有显着的差异（P<0.01）;④手术组（MMT 组）的第 2 周（F=31.299,P=0.000<0.01）、4周（F=46.216,P=0.000<0.01）、8 周（F=76.991,P=0.000<0.01）、12 周（F=2243.23,P=0.000<0.01）的骨小梁厚度（Tb.Th）均有显着差异（P<0.01）;⑤手术组（MMT组）的第 2 周（F=29.937,P=0.000<0.01）、4 周（F=43.307,P=0.000<0.01）、8 周（F=70.283,P=0.000<0.01）、12 周（F=104.784,P=0.000<0.01）的骨小梁量（Tb.N）均有显着的差异（P<0.01）;⑥手术组（MMT组）的第2周（F=69.158,P=0.000<0.01）、4 周（F=105.204,P=0.000<0.01）、8 周（F=216.123,P=0.000<0.01）、12 周（F=354.133,P=0.000<0.01）的胶原矿化比（Proline/PO43-）均有显着的差异（P<0.01）;⑦手术组（MMT组）的第2周的软骨下骨弹性模量（Er）有差异（F=7.948,P=0.003<0.01）,4 周（F=33.725,P=0.000<0.01）、8 周（F=5.034,P=0.018<0.05）、12 周（F=19.931,P=0.000<0.01）,软骨下骨弹性模量（Er）均有差异（P<0.05）;⑧手术组（MMT组）的第2周（F=15.998,P=0.000<0.01）、4 周（F=42.356,P=0.000<0.01）、8 周（F=48.658,P=0.000<0.01）、12 周（F=45.604,P=0.000<0.01）的骨小梁硬度（H）均有显着的差异（P<0.01）;⑨手术组（MMT组）的第 2 周（F=22.156,P=0.000<0.01）,4 周（F=44.051,P=0.000<0.01）、8周（F=133.707,P=0.000<0.01）、12 周（F=294.919,P=0.000<0.01）的 TNF-α 表达水平均有显着差异（P<0.01）;⑩手术组（MMT组）的第2周（F=3.973,P=0.037<0.05）,4 周（F=16.642,P=0.000<0.01）、8 周（F=60.168,P=0.000<0.01）、12 周（F=101.456,P=0.000<0.01）的 TGF-β 1 表达水平均有差异（P<0.05）。且测得各项参数中手术组间随时间变化有显着差异（P<0.01）,假手术组、空白对照组各组组间无明显差异（P>0.05）。结论:本研究发现胫骨外侧平台主要处于OA早期,而内侧平台多处于OA中、晚期,因此,采用骨组织形态计量学方法对比分析膝关节OA胫骨内、外侧平台骨软骨结构参数的差异,有助于定量分析OA早期和晚期骨软骨结构改变的程度。建立了大鼠膝关节半月板损伤模型（MMT模型）,采用自身对照方法分别观察了TNF-α和TGF-β1在不同时间点软骨下骨组织中的表达,发现了 TNF-α/TGF-β1信号轴在半月板损伤后骨关节炎软骨下骨改变病变中的作用机制为双向调节,正负反馈的机制,与中医阴阳平衡的理论不谋而合。研究分析MMT模型致骨关节炎（OA）,于伤后不同时间点检测软骨下骨微结构、矿化及力学性质的动态变化,定性、定量观测软骨下骨的组织形态学、分子生物、生物力学变化与TNF-α/TGF-β1信号轴变化的动态关系,总结TNF-α/TGF-β1信号轴可能为治疗半月板损伤后导致骨关节炎提供了科学依据和重要指导工具。
刘中兵[10]（2020）在《川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应研究》文中提出第一部分:川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应体外研究目的:充分探讨川陈皮素靶向IL-21调控类风湿关节炎免疫应答过程,确定其与IL-21/IL-21R及JAK1/STAT3信号通路在调控过程中的介导关系,确定川陈皮素在类风湿关节炎发生、发展过程中的价值性,为后期临床治疗类风湿关节炎提供研究方向。材料与方法:我们使用的是RASFs细胞系,即MH7A细胞,它来自RA患者,被认为是RA的主要效应细胞。MH7A细胞系使用含10%胎牛血清的1640完全培养基于37℃、5%CO2、100%的恒温培养箱中培养,具体分组如下:Control组（不做处理）;IL-21组（50 ng/ml IL-21处理MH7A细胞）;IL-21+Nobiletin 25μM组（50ng/ml IL-21+25μmol/L Nobiletin处理MH7A细胞）;IL-21+Nobiletin 50μM组（50ng/ml IL-21+50μmol/L Nobiletin处理MH7A细胞）;MH7A细胞干预结束后,继续培养48小时后进行相关项目分析:细胞因子分析:ELISA检测各组细胞中IL-6、TNF-α、HMGB1、MMP-3、MMP-13表达浓度分析;各组MH7A细胞ROS（活性氧）检测;各组MH7A细胞4-HNE（4-羟基壬烯醛）检测;RT-PCR检测IL-21R、IL-6、TNF-α、MMP-3、MMP-13表达浓度分析;Western-blot检测IL-21R及JAK1/STAT3信号通路关键蛋白表达分析;统计数据,给出结论。结果:ELISA化学检测:IL-6、TNF-α:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;HMGB1蛋白:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;4-HNE检测:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;ROS检测:各组MH7A细胞中的ROS表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;RT-PCR检测:IL-21R:各组MH7A细胞m RNA表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;IL-6、TNF-α:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;Westwen-blot检测:IL-21R:各组MH7A细胞蛋白浓度表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;JAK1/STAT3信号通路:各组MH7A细胞中JAK1、STAT3蛋白表达差异性较小,P>0.05,差异不具有统计学意义;在其磷酸的表达过程中,各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:（1）川陈皮素可以靶向IL-21受体对MH7A细胞做出免疫应答过程,明显降低MH7A滑膜细胞内白细胞介素以及基质金属蛋白酶等浓度变化,缓解MH7A滑膜细胞的炎性进展过程,促进其修复过程,且随着川陈皮素浓度增加,这种趋势更加明显。（2）川陈皮素可以靶向IL-21受体对细胞经典信号通路JAK1/STAT3进行调控应答,降低细胞信号通路关键蛋白JAK1及STAT3等蛋白的磷酸化水平,减缓炎症过程,与上文的结论具有一致性。由此可以得知,川陈皮素在类风湿关节炎的发生、发展过程中可能具有潜在的研究价值,为后期临床治疗类风湿关节炎提供靶向研究导向。第二部分:川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应体内研究目的:在体外研究的基础上,体内研究进一步探讨了川陈皮素靶向IL-21调控类风湿关节炎的免疫应答过程,从而明确了其与IL-21/IL-21R及JAK1/STAT3信号通路在调控过程中的介导关系,表明了川陈皮素在抗类风湿关节炎症作用方向的价值性,为后期临床治疗类风湿关节炎提供研究方向。材料与方法:选取48只Wistar大鼠适应性饲养1周后将其随机分成4组,除去对照组大鼠,其余建立CIA模型;具体分组如下:Control组（大鼠不做处理）;IL-21组（CIA模型+50 ng/ml IL-21,腹腔注射）;IL-21+Nobiletin 25μM组（CIA模型+50 ng/ml IL-21+25μmol/L Nobiletin,腹腔注射）;IL-21+Nobiletin 50μM组（CIA模型+50 ng/ml IL-21+50μmol/L Nobiletin,腹腔注射）;继续饲养6周后将大鼠处死,进行相关项目分析:各组大鼠模型成功率检测:大体观察、体重指数、关节炎、关节指数分析;形态学分析:各组大鼠HE染色分析;ELISA检测分析:IL-21R、TNF-α、IL-6、HMGB1、MMP-3及MMP-13蛋白;RT-PCR检测分析IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3及MMP-13m RNA表达分析;Western-blot检测分析IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3及MMP-13及JAK1/STAT3通路分析,分析数据,给出结论。结果:模型成功率检测:临床表现:对照组大鼠精神状态较好,体重体现出稳步增长的趋势,毛发光泽性较差;模型组大鼠意志沉迷,进食量逐渐减少,毛发光泽性,2周后处于无法负重的状态;体重变化:两周后各组大鼠的体重变化趋势为IL-21<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21+Nobiletin 50μM<Control,各组之间体重比较,差异具有统计学意义（P<0.05）;关节炎发病率/关节指数:各组关节炎发病率比较趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,数据分析差异具有统计学意义（P<0.05）.形态学分析:HE染色:对照组大鼠踝关节组织细胞排列密集,形态规则,轮裹明显;模型组大鼠踝关节组织细胞层变厚,白细胞和淋巴细胞大量充斥,连续性减弱;川陈皮素干预后,大鼠的踝关节组织细胞排列密集性加强,细胞形态趋于正常。ELISA化学检测:IL-6、TNF-α:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;HMGB1蛋白:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义。RT-PCR检测:IL-21R:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;IL-6、TNF-α:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义。Westwen-blot检测:IL-21R:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;IL-6、TNF-α:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;JAK1/STAT3信号通路:各组MH7A细胞中JAK1、STAT3蛋白表达差异性较小,P>0.05,差异不具有统计学意义;在其磷酸的表达过程中,表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:（1）川陈皮素可以较好的改善模型组大鼠关节炎效应,明显改善大鼠的精神状态,降低大鼠的类风湿关节炎症的程度及关节指数,为后续的研究提供帮助。（2）与体外研究结果一致,川陈皮素改善大鼠类风湿关节炎症的作用主要是通过靶向机体IL-21R浓度变化进而调控JAK1/STAT3的活性状态,充分降低白细胞介素、肿瘤坏死因子-α、高迁移率蛋白表达,逐渐恢复关节软骨基质合成及分解的平衡状态,加速类风湿关节炎疾病的康复过程,达到对类风湿关节炎的治疗效果,给予临床一定启发。
二、转化生长因子β_1与类风湿关节炎滑膜病理改变的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转化生长因子β_1与类风湿关节炎滑膜病理改变的关系（论文提纲范文）
（1）LncRNA PlncRNA-1靶向miR-146a/TGF-β1轴参与类风湿性关节炎发生发展机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 LncRNA PlncRNA-1、miR-146a/TGF-β1轴参与类风湿性关节炎发生发展体内研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验试剂及仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 研究小结 |
| 第二部分 LncRNA PlncRNA-1、miR-146a及TGF-β1对类风湿性关节炎患者病情严重程度的评估价值研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验试剂及仪器 |
| 1.3 相关标准 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 研究小结 |
| 第三部分 LncRNA PlncRNA-1靶向miR-146a/TGF-β1轴参与类风湿性关节炎发生发展机制体外研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验试剂及仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 研究小结 |
| 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 长链非编码RNA在类风湿性关节炎发生及发展中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（2）万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎机制研究及16S rDNA高通量测序和代谢组学分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 类风湿关节炎概述 |
| 1.2 类风湿关节炎发病机制 |
| 1.2.1 触发阶段 |
| 1.2.2 成熟阶段 |
| 1.2.3 靶向阶段 |
| 1.2.4 爆发性阶段 |
| 1.3 类风湿性关节炎现代药物疗法 |
| 1.3.1 传统DMARDs |
| 1.3.2 生物DMARDs |
| 1.3.3 小分子DMARDs |
| 1.4 肠道微生物群与类风湿关节炎 |
| 1.4.1 肠道菌群与免疫调节细胞 |
| 1.4.2 肠道菌群介导炎症性关节炎 |
| 1.4.3 肠道菌群介导类风湿关节炎治疗 |
| 1.4.4 益生菌 |
| 1.5 中草药对RA-FLSs细胞凋亡的影响及机制 |
| 1.5.1 RA-FLSs细胞凋亡 |
| 1.5.2 死亡受体介导的凋亡途径 |
| 1.5.3 线粒体依赖性凋亡途径 |
| 1.5.4 .NF-κB介导的凋亡途径 |
| 1.5.5 MAPK介导的凋亡途径 |
| 1.5.6 .其他凋亡途径 |
| 1.6 万通筋骨片研究进展 |
| 1.7 技术路线 |
| 第2章 万通筋骨片在类风湿性关节炎中的抗炎作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂与耗材 |
| 2.2.3 实验细胞与实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大鼠急毒实验 |
| 2.3.2 CIA大鼠模型建立 |
| 2.3.3 动物分组与给药 |
| 2.3.4 酶联免疫吸附试验 |
| 2.3.5 HE染色 |
| 2.3.6 免疫组化分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 万通筋骨片安全给药浓度 |
| 2.4.2 CIA大鼠模型 |
| 2.4.3 万通筋骨片对RA具有抗炎作用 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 万通筋骨片在类风湿性关节炎中的抗炎机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂与耗材 |
| 3.2.3 实验细胞与实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 万通筋骨片溶液配制 |
| 3.3.2 RA-FLSs细胞培养 |
| 3.3.3 细胞形态观察 |
| 3.3.4 RA-FLSs细胞增殖检测 |
| 3.3.5 蛋白免疫印迹分析 |
| 3.3.6 实时荧光定量PCR分析 |
| 3.3.7 细胞免疫荧光 |
| 3.3.8 质粒转染 |
| 3.3.9 Caspase-3/9蛋白酶活性检测 |
| 3.3.10 免疫组化分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 万通筋骨片乙醇提取物对RA-FLSs细胞的影响 |
| 3.4.2 MEK/ERK信号通路介导万通筋骨片的抗炎作用 |
| 3.4.3 万通筋骨片乙醇提取物促进RA-FLSs细胞凋亡 |
| 3.4.4 线粒体依赖性凋亡途径介导万通筋骨片的抗炎作用 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 基于RNA高通量测序挖掘万通筋骨片对RA的抗炎靶点 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验试剂与耗材 |
| 4.2.3 实验分析软件 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 RA-FLSs细胞培养与分组 |
| 4.3.2 样品收集和准备 |
| 4.3.3 数据分析 |
| 4.3.4 实时荧光定量PCR |
| 4.3.5 蛋白免疫印迹 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 DESeq2差异分析 |
| 4.4.2 差异基因功能注释分析 |
| 4.4.3 KEGG富集通路提取及蛋白互作网络分析 |
| 4.4.4 STEM时间聚类分析 |
| 4.4.5 权重共表达网络分析及功能富集分析 |
| 4.4.6 基因共表达网络分析及蛋白互作网络分析 |
| 4.4.7 核心基因筛选与验证 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 基于16S高通量测序和代谢组学联合分析挖掘万通筋骨片对RA的抗炎靶点 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验仪器 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验分析软件 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 16S rDNA扩增子测序 |
| 5.3.2 16S rDNA扩增子信息分析 |
| 5.3.3 代谢物提取 |
| 5.3.4 色谱条件 |
| 5.3.5 质谱条件 |
| 5.3.6 代谢物鉴定 |
| 5.3.7 肠道菌群与代谢物联合分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 万通筋骨片改变CIA大鼠肠道菌群结构 |
| 5.4.2 万通筋骨片作用特定肠道菌群 |
| 5.4.3 万通筋骨片改变CIA大鼠血清代谢物谱 |
| 5.4.4 差异代谢物筛选 |
| 5.4.5 靶点代谢物筛选 |
| 5.4.6 16S rDNA高通量测序与代谢物组学联合分析 |
| 5.5 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 附表 |
（3）ELP修饰的生物功能材料用于治疗关节炎和软骨缺损的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 类风湿关节炎 |
| 1.1.1 类风湿关节炎的病理生理机制 |
| 1.1.2 类风湿关节炎的药物治疗 |
| 1.2 痛风关节炎 |
| 1.2.1 痛风关节炎的病理生理机制 |
| 1.2.2 痛风关节炎的抗炎治疗 |
| 1.3 IL-1β在关节炎症中的作用和作为疾病治疗靶点的研究现状 |
| 1.3.1 IL-1β在关节炎症病理改变中的作用 |
| 1.3.2 IL-1β在关节炎症中作为治疗靶点的研究现状 |
| 1.3.3 IL-1Ra药物的修饰和递送策略——ELP修饰及非共价纳米组装 |
| 1.4 软骨缺损及修复 |
| 1.4.1 软骨缺损概述 |
| 1.4.2 软骨修复用生物材料综述 |
| 1.4.3 软骨修复当前面临的主要挑战及策略 |
| 1.5 课题设计和研究内容 |
| 第2章 基于ELP修饰的IL-1Ra纳米生物制剂的制备和表征 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果和讨论 |
| 2.3.1 人工重组融合蛋白IL-1Ra-K72 的制备 |
| 2.3.2 纳米生物制剂的制备和形貌特点 |
| 2.3.3 纳米生物制剂体外释放蛋白药物的性能特点 |
| 2.3.4 纳米生物制剂的细胞相容性检测 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 基于ELP修饰的IL-1Ra纳米生物制剂治疗大鼠类风湿关节炎的实验研究 |
| 3.1 概述 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 纳米药物体外生物活性 |
| 3.3.2 纳米药物在雌性大鼠体内的药代动力学特点 |
| 3.3.3 类风湿关节炎大鼠造模及评价 |
| 3.3.4 纳米药物用药间隔筛选 |
| 3.3.5 纳米药物对类风湿关节炎大鼠的治疗作用 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 基于ELP修饰的IL-1Ra纳米生物制剂治疗大鼠痛风关节炎的实验研究 |
| 4.1 概述 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 纳米药物体外阻断IL-1β的生物活性 |
| 4.3.2 纳米药物在雄性大鼠体内的药代动力学特点 |
| 4.3.3 纳米药物对痛风关节炎大鼠的治疗作用 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 基于ELP和硫酸软骨素的生物粘合剂的制备及其用于修复大鼠软骨缺损的实验研究 |
| 5.1 概述 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果和讨论 |
| 5.3.1 粘合剂制备和理化性能 |
| 5.3.2 KPC粘合剂的细胞相容性和体外生物活性 |
| 5.3.3 KPC粘合剂对大鼠软骨缺损的修复治疗作用 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在读期间的学术成果 |
| 致谢 |
（4）类风湿关节炎合并肺间质病变影响因素的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 第2章 资料和方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 诊断标准 |
| 2.3 纳入标准 |
| 2.4 排除标准 |
| 2.5 研究方法 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 RA患者临床特征分析 |
| 3.2 RA-ILD影响因素分析 |
| 3.3 血脂异常与RA-ILD的相关性分析 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 类风湿关节炎合并肺间质病变的发病机制及相关因素研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）基于miR-126调控的VEGF/PI3K/AKT通路研究新风胶囊对类风湿关节炎滑膜血管新生的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文略缩词表 |
| 前言 |
| 第一部分 临床研究 |
| 1 对象和方法 |
| 1.1 病例选择 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 纳入标准及排除标准 |
| 1.4 病例分组 |
| 1.5 治疗方案 |
| 1.6 主要仪器设备和试剂 |
| 1.7 评价标准 |
| 1.8 观察指标 |
| 1.9 伦理学要求 |
| 1.10 统计学处理方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RA患者各指标的变化 |
| 2.2 RA患者血清VEGF与各指标的相关性分析 |
| 2.3 RA患者血清VEGF与中医证候及生活质量的相关性分析 |
| 2.4 XFC治疗RA患者的临床疗效 |
| 2.5 XFC对各指标的影响 |
| 2.6 XFC对中医证候及生活质量的影响 |
| 2.7 病例脱落和副作用发生情况 |
| 3 讨论 |
| 3.1 RA滑膜血管新生的中医认识 |
| 3.2 临床药物选择的依据 |
| 3.3 XFC药理学研究 |
| 3.4 本研究所选主要观测指标的依据及意义 |
| 3.5 XFC的临床疗效及对滑膜血管新生的影响 |
| 3.6 XFC改善RA患者滑膜血管新生可能的机制 |
| 4 结论 |
| 4.1 XFC对RA患者的临床疗效及对血管新生的影响 |
| 4.2 XFC改善RA患者血管新生机制 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要药品及试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 模型复制及给药 |
| 1.5 观察指标 |
| 1.6 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 AA大鼠体质量、足趾肿胀度和AI变化及XFC对其影响 |
| 2.2 AA大鼠滑膜血管新生相关变化及XFC对其影响 |
| 2.3 AA大鼠细胞因子变化及XFC对其的影响 |
| 2.4 AA大鼠HIF-1α、miR-126 变化及XFC对其影响 |
| 2.5 AA大鼠VEGF/PI3K/AKT信号通路变化及XFC对其的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 实验方法的建立 |
| 3.2 主要观测指标的选择理由及意义 |
| 3.3 XFC对AA大鼠的疗效分析 |
| 3.4 XFC对 AA大鼠miR-126-VEGF/PI3K/AKT信号通路的影响 |
| 3.5 XFC对AA大鼠滑膜血管新生的作用机制探讨 |
| 4 结论 |
| 4.1 XFC对AA大鼠关节症状及滑膜血管新生的影响 |
| 4.2 XFC对AA大鼠滑膜血管新生的作用机制 |
| 参考文献 |
| 综述 中医药治疗类风湿关节炎研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（6）MicroRNA-10b通过干扰CD4+T细胞亚型平衡促进关节炎的发展（论文提纲范文）
| 英文缩略词表(Abbreviation) |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 类风湿关节炎病人滑膜组织样本 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 细胞 |
| 2.4 试剂和抗体 |
| 2.4.1 试剂 |
| 2.4.2 抗体 |
| 2.5 实验仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 miR-10b在 RA患者中的表达情况 |
| 3.1.1 RT-qPCR检测miR-10b在RA患者PBMC中的表达情况 |
| 3.1.2 RT-qPCR检测miR-10b在RA患者滑膜组织中的表达情况 |
| 3.1.3 FISH检测miR-10b在RA患者滑膜组织中的表达情况 |
| 3.2 miR-10b基因敲除小鼠基因型鉴定 |
| 3.2.1 鼠尾DNA提取 |
| 3.2.2 PCR扩增 |
| 3.2.3 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.3 mi R-10b基因敲除对CAIA小鼠关节炎模型的影响 |
| 3.3.1 CAIA小鼠关节炎模型构建 |
| 3.3.2 CAIA小鼠关节炎模型整体指标评价 |
| 3.3.3 CAIA小鼠关节炎模型膝关节病理改变及评分 |
| 3.4 CAIA小鼠关节炎模型PBMC和滑膜组织RNA测序 |
| 3.5 MiR-10b对 CD4~+T细胞分化的影响 |
| 3.5.1 流式分选CD4~+T细胞 |
| 3.5.2 CD4~+T转染 |
| 3.5.3 流式检测miR-10b对CD4~+T细胞的作用 |
| 3.6 miR-10b靶基因预测及验证 |
| 3.6.1 生物信息学预测miR-10b的潜在靶点 |
| 3.6.2 双荧光素酶检测miR-10b与其靶点的直接结合作用 |
| 3.6.3 Western blot检测miR-10b对靶点的抑制作用 |
| 3.7 免疫组化检测GATA3和PTEN在类风湿关节炎患者滑膜组织中表达情况 |
| 3.8 MiR-10b靶基因GATA3及PTEN敲低对CD4~+T细胞分化的影响 |
| 3.8.1 siRNA最优序列的选取 |
| 3.8.2 GATA3和PTEN siRNA对CD4~+T亚群分化的影响 |
| 3.9 miR-10b抑制剂对小鼠CIA模型的治疗作用 |
| 3.9.1 建立小鼠CIA模型 |
| 3.9.2 小鼠CIA模型整体指标评价 |
| 3.9.3 膝关节病理变化检查 |
| 3.9.4 胸腺指数和脾脏指数检测 |
| 3.9.5 免疫组化检测小鼠CD4的表达 |
| 3.9.6 流式细胞术检测小鼠CD4~+T 细胞亚群比例变化 |
| 3.10 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 miR-10b在RA患者中表达情况 |
| 4.1.1 miR-10b在RA患者PBMC中表达情况 |
| 4.1.2 miR-10b在RA患者滑膜组织中表达情况 |
| 4.1.3 miR-10b在RA患者滑膜组织中的定位 |
| 4.2 miR-10b基因敲除对CAIA模型的影响 |
| 4.2.1 小鼠繁育及基因型鉴定 |
| 4.2.2 miR-10b基因敲除对CAIA小鼠关节炎指数和关节肿胀数的影响 |
| 4.2.3 miR-10b基因敲除对CAIA小鼠膝关节病理的影响 |
| 4.3 miR-10b促进CAIA关节炎模型发生与发展的作用机制 |
| 4.3.1 CAIA关节炎模型组织RNA测序 |
| 4.3.2 异常表达基因的KEGG信号通路分析 |
| 4.3.3 CD4~+T细胞分选策略 |
| 4.3.4 CD4~+T细胞转染效率 |
| 4.3.5 miR-10b模拟物对CD4~+T细胞亚群分化的影响 |
| 4.3.6 miR-10b抑制剂对CD4~+T细胞亚群分化的影响 |
| 4.4 mi R-10b调节CD4~+T 细胞亚群分化的作用机制 |
| 4.4.1 miR-10b靶基因预测结果 |
| 4.4.2 MiR-10b与靶基因的直接结合作用 |
| 4.4.3 miR-10b对靶基因蛋白表达的影响 |
| 4.4.4 RA患者滑膜组织中GATA3和PTEN的表达情况 |
| 4.4.5 CAIA小鼠膝关节中GATA3和PTEN的表达情况 |
| 4.5 GATA3和PTEN siRNA对CD4~+T细胞亚群分化的影响 |
| 4.5.1 筛选GATA3 siRNA结果 |
| 4.5.2 筛选PTEN siRNA结果 |
| 4.5.3 GATA3 siRNA对Th1和Th2细胞分化的影响 |
| 4.5.4 PTEN siRNA对Th17和Treg细胞分化的影响 |
| 4.6 Mi R-10b抑制剂对小鼠CIA模型的治疗作用 |
| 4.6.1 建立DBA/1小鼠CIA模型 |
| 4.6.2 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠体重的影响 |
| 4.6.3 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠关节炎指数和关节炎肿胀数的影响 |
| 4.6.4 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠足爪厚度的影响 |
| 4.6.5 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠膝关节病理改变的影响 |
| 4.6.6 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠指关节和膝关节软骨破坏的影响 |
| 4.6.7 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠脾脏病理改变的影响 |
| 4.6.8 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响 |
| 4.6.9 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠膝关节病理和血管化的影响 |
| 4.6.10 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠膝关节滑膜CD4表达的影响 |
| 4.6.11 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠膝关节滑膜GATA3和PTEN表达的影响 |
| 4.6.12 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠脾脏CD4表达的影响 |
| 4.6.13 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠PBMC中CD4~+T细胞亚群的影响 |
| 4.6.14 MiR-10b抑制剂对CIA小鼠脾脏中CD4~+T细胞亚群的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 7 课题创新点 |
| 8 下一步计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述:成纤维样滑膜细胞调节的滑膜炎在骨关节炎发病机制中的研究进展 |
| 参考文献 |
（7）蒙药三子汤为基础的系列方剂对CIA大鼠关节新生血管的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 类风湿关节炎血管新生病理介质的研究概况 |
| 1 概述 |
| 2 巨噬细胞和滑膜成纤维细胞与RA血管新生 |
| 3 参与血管生成病理介质的研究概况 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 中蒙药对RA抗血管生成作用的实验研究进展 |
| 1 概述 |
| 2 RA与血管新生 |
| 3 中药抗RA血管新生作用的实验研究进展 |
| 4 蒙药抗RA血管新生作用的研究进展 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 三子汤为基础的系列方剂对CIA大鼠关节炎症的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 三子汤为基础的系列方剂对CIA大鼠血管新生的影响及机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 三子汤为基础的系列方剂含药血清对体外RA-FLS、HUVEC细胞增殖和血管新生相关细胞因子的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（8）地塞米松及其温敏凝胶制剂对CIA大鼠的治疗机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词对照表 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一章:DEX对大鼠胶原性关节炎的抑制作用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章:DEX对CIA大鼠疼痛的抑制作用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章:DEX对CIA大鼠脾脏免疫功能的调节作用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章:DLTH对CIA大鼠关节炎的治疗作用及机制 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结与展望 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
（9）TNFTNF-α/TGF/TGF-β1信号轴调控半月板损伤后软骨下骨的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 祖国医学对半月板损伤和骨关节炎的认识 |
| 第一节 祖国医学对半月板损伤的认识 |
| 一、病名 |
| 二、中医病因病机 |
| 三、证候分型 |
| 四、中医治疗 |
| 第二节 祖国医学对膝骨关节炎的认识 |
| 一、病名 |
| 二、中医病因病机 |
| 三、证候分型 |
| 四、中医治疗 |
| 第三节 祖国医学对半月板损伤与膝骨关节炎的理论基础 |
| 一、筋骨并重理论 |
| 二、中医“治未病”理念 |
| 第二章 文献研究 |
| 第一节 半月板损伤的研究概况 |
| 一、半月板的研究历史 |
| 二、半月板损伤的流行病学 |
| 三、半月板的解剖结构与功能 |
| 四、半月板损伤的机制 |
| 五、半月板损伤的类型 |
| 六、半月板损伤的诊断 |
| 七、半月板损伤的治疗 |
| 第二节 半月板损伤骨关节炎的研究概况 |
| 一、半月板损伤骨关节炎的现代医学研究介绍 |
| 二、半月板损伤骨关节炎动物模型的研究介绍 |
| 第三节 半月板损伤骨关节炎软骨下骨改变的研究概况 |
| 一、软骨下骨的介绍 |
| 二、半月板损伤骨关节炎软骨下骨改变的研究介绍 |
| 第四节 TNF-α/TGF-β1 信号轴的研究概况 |
| 一、TNF-α的研究进展 |
| 二、TGF-β1 的研究进展 |
| 三、TNF-α/TGF-β1 信号轴的研究介绍 |
| 第三章 临床部分 |
| 第一节 人半月板损伤后膝骨关节炎的实验研究 |
| 一、Micro-CT检测软骨下骨改变 |
| 第二节 血清中TNF-α/TGF-β1 信号轴的改变 |
| 一、临床资料 |
| 第四章 实验材料与动物分组 |
| 第一节 实验内容 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 一、分组和模型 |
| 二、方法 |
| 三、TNF-α和 TGF-β1 的检测 |
| 四、统计分析 |
| 第四节 实验结果 |
| 一、各组甲苯胺蓝染色比较 |
| 二、各组胫骨近端横断位的Micro-CT成像图比较 |
| 三、软骨下骨微结构参数变化 |
| 四、各组血清中TNF-α表达水平比较 |
| 五、各组血清中TGF-β1 表达水平比较 |
| 第五章 讨论 |
| 第一节 MMT大鼠模型构建及结果分析 |
| 第二节 半月板损伤骨关节炎中软骨下骨改变的意义 |
| 第三节 TNF-α/TGF-β1 信号轴在软骨下骨改变中的机制研究 |
| 第四节 中医对TNF-α/TGF-β1 信号轴与半月板损伤后骨关节炎软骨下骨改变的理解 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（10）川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 1.类风湿关节炎 |
| 1.1 疾病介绍 |
| 1.2 滑膜成纤维细胞代谢与类风湿关节炎 |
| 1.3 细胞因子与类风湿关节炎 |
| 2.IL-21/IL-21R信号转导途径 |
| 2.1 IL-21/IL-21R产生及来源 |
| 2.2 IL-21/IL-21R对疾病的调节 |
| 2.3 IL-21/IL-21R与类风湿关节炎 |
| 3.JAK/STAT信号通路与类风湿关节炎 |
| 3.1 JAK/STAT信号通路 |
| 3.2 基本过程及调节 |
| 3.3 JAK/STAT与类风湿关节炎 |
| 4.川陈皮素药理性作用 |
| 4.1 名称介绍 |
| 4.2 药代动力学 |
| 4.3 药理作用 |
| 5.本研究的目的和内容 |
| 第一部分 :川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎炎症反应体外研究 |
| 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验试剂及设备 |
| 1.3 实验过程 |
| 1.4 实验分析 |
| 1.5 统计学分析 |
| 结果 |
| 2.1 川陈皮素对MH7A细胞活力的影响 |
| 2.2 川陈皮素能够抑制IL-21受体的表达 |
| 2.3 川陈皮素抑制IL-21诱导的氧化应激反应 |
| 2.4 川成皮素抑制促炎细胞因子的表达 |
| 2.5 川陈皮素抑制IL-21 诱导的基质金属蛋白酶(MMPs)表达 |
| 2.6 川陈皮素的作用通过JAK1/STAT3 信号通路介导 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 第二部分 :川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎炎症反应体内研究 |
| 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验试剂及设备 |
| 1.3 实验试剂配置 |
| 1.4 实验过程 |
| 1.5 统计学分析 |
| 结果 |
| 2.1 模型成功率检测 |
| 2.2 形态学分析表明川陈皮素对类风湿关节炎的改善作用 |
| 2.3 ELISA检测IL-21R、TNF-α、IL-6、HMGB1、MMP-3及MMP-13 提示川陈皮素对类风湿关节炎炎症的的抑制效应 |
| 2.4 RT-PCR检测IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3、MMP-13从m RNA水平进一步表明川陈皮素抑制类风湿关节炎炎症的水平 |
| 2.5 Western-blot检测IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3、MMP-13、JAK1/STAT3从蛋白水平进一步充分表明川陈皮素的类风湿关节炎炎症抑制作用 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 参考文献 |
| 综述 白细胞介素21在类风湿关节炎中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
四、转化生长因子β_1与类风湿关节炎滑膜病理改变的关系（论文参考文献）
- [1]LncRNA PlncRNA-1靶向miR-146a/TGF-β1轴参与类风湿性关节炎发生发展机制研究[D]. 汪洋. 新疆医科大学, 2021
- [2]万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎机制研究及16S rDNA高通量测序和代谢组学分析[D]. 李兆东. 吉林大学, 2021(01)
- [3]ELP修饰的生物功能材料用于治疗关节炎和软骨缺损的实验研究[D]. 张津瑞. 吉林大学, 2021(01)
- [4]类风湿关节炎合并肺间质病变影响因素的研究[D]. 吴琦. 汕头大学, 2021(02)
- [5]基于miR-126调控的VEGF/PI3K/AKT通路研究新风胶囊对类风湿关节炎滑膜血管新生的作用机制[D]. 龚雪. 安徽中医药大学, 2021(01)
- [6]MicroRNA-10b通过干扰CD4+T细胞亚型平衡促进关节炎的发展[D]. 韩大飞. 安徽医科大学, 2021(01)
- [7]蒙药三子汤为基础的系列方剂对CIA大鼠关节新生血管的影响[D]. 敖丽梅. 北京中医药大学, 2020(04)
- [8]地塞米松及其温敏凝胶制剂对CIA大鼠的治疗机制研究[D]. 许冰馨. 上海交通大学, 2020(01)
- [9]TNFTNF-α/TGF/TGF-β1信号轴调控半月板损伤后软骨下骨的研究[D]. 贾琼. 广州中医药大学, 2020(09)
- [10]川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应研究[D]. 刘中兵. 苏州大学, 2020(06)
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