一、超声处理对大肠杆菌HCV-NS_3融合蛋白纯化的影响（论文文献综述）
郭军培[1]（2021）在《猪GRP多克隆抗体的制备与应用及其对Leydig cells睾酮分泌的影响》文中指出胃泌素释放肽（Gastrin-releasingpeptide,GRP）是1979年从猪的胃组织中分离得到的一种神经肽,是哺乳动物蛙皮素样肽家族中的一员,在体内GRP通过与其受体（Gastrin-releasing peptide receptor,GRPR）结合发挥多种生理功能。GRP及其受体在多种动物的神经系统和外周组织中广泛表达,参与调控体内多种生物学作用,包括:促进正常/肿瘤细胞的增殖分化、促进胰液分泌、调节应激和恐惧等情绪性行为、参与调控摄食和节律等。自GRP发现以来,目前大多数关于GRP及其受体功能的研究都集中于人和大小鼠上,关于猪体内GRP的表达及其生物学作用的研究较缺乏。为研究GRP在猪体内的分布情况,我们首先制备了猪GRP多克隆抗体,并研究了GRP蛋白在猪体内的分布。本课题组前期研究结果表明,GRP可能对公猪的生殖功能具有调控作用,因此本试验以猪Leydig cells为模型,研究GRP对猪Leydig cells睾酮分泌/合成、增殖及凋亡的影响。通过以上研究旨在发现GPR在猪体内可能存在的生理功能及对猪Leydig cells的影响,为进一步研究GRP对公猪生殖相关激素的调控机制奠定基础。1.猪GRP多克隆抗体的制备本试验通过大肠杆菌原核表达技术,构建了重组表达载体pET32a（+）-pGRP,并转化到表达菌株BL21（DE3）获得pGRP融合蛋白表达菌株,IPTG诱导表达菌株获得Histag-pGRP融合蛋白,以纯化后的融合蛋白为免疫原,制定免疫程序免疫试验动物后获得抗血清,即为制备的多克隆抗体。具体如下:（1）根据猪GRP基因序列,设计并合成添加酶切位点的引物序列;通过PCR扩增获得pGRP目的片段,包括全长开放阅读框（441 bp）,编码146个氨基酸;随后与pMD19T连接构建pMD19T-pGRP重组质粒;将pMD19T-pGRP和pET32a（+）质粒经双酶切线性化后连接构建pET32a（+）-pGRP重组表达载体;并转化至表达菌株BL21（DE3）中获得BL21（DE3）-pET32a（+）-pGRP融合蛋白表达菌株。（2）利用IPTG诱导BL21（DE3）-pET32a（+）-pGRP融合蛋白表达菌株获得His-tag-pGRP融合蛋白,并对获得的蛋白进行检测和纯化。（3）制定免疫程序后,以纯化后的融合蛋白为免疫原免疫试验动物家兔,并获得抗血清;采用ELISA检测抗血清的效价为1:50,000,并通过Western Blot检测抗血清的反应原性;纯化后的抗血清即为制备的多克隆抗体。2.GRP在猪体内的分布定位和表达本部分主要通过IHC和Western Blot检测GRP蛋白在猪组织中的分布表达情况。结果表明:GRP蛋白在猪的中枢神经系统和外周组织器官中都有表达,其中在中枢神经系统GRP蛋白主要表达在下丘脑、小脑等组织;在外周组织中主要表达在胃肠道和泌尿生殖道。综上所述,GRP蛋白在猪体内的广泛存在表明GRP可能对猪的多种生理功能具有调节作用。3.GRP对猪Leydigcells的影响为研究GRP对猪Leydig cells的影响,我们使用一定浓度的GRP处理猪Leydig cells,收集上清和蛋白样品分别进行如下检测:检测GRPR蛋白在Leydig cells中表达,结果表明一定浓度（1和10 nM）的GRP可以显着促进GRPR蛋白的表达;检测上清中睾酮分泌和睾酮合成相关蛋白（StAR、CYP11A1和HSD3B2）表达的影响,结果表明GRP能够促进睾酮的分泌,其中1和10nM的GRP能够显着增加睾酮的浓度（P<0.01和P<0.05）;Western Blot结果也表明不同浓度GRP处理细胞对睾酮合成相关蛋白（StAR、CYP11A1和HSD3B2）的表达有一定的促进作用;进一步检测了GRP对Leydig cells细胞增殖和凋亡的影响,CCK-8结果表明GRP对细胞活性有一定的作用,GRP浓度为1和10nM时能够显着增加细胞数量（P<0.01和P<0.05）;Western Blot检测结果表明一定浓度的GRP对Cyclin B1蛋白表达有促进作用,但是对PCNA影响不显着;同时流式细胞术检测结果表明一定剂量的GRP能够促进细胞凋亡并促进凋亡相关蛋白的表达;检测了GRP处理对G-蛋白偶联受体信号通路中pPKC/PKC和pPKA/PKA蛋白表达的影响,结果显示一定浓度的GRP能够增加pPKC/PKC的比值,但是对pPKA/PKA的比值影响不显着。该论文构建重组表达载体pET32a（+）-pGRP并制备猪GRP多克隆抗体,通过IHC和Western Blot检测GRP蛋白猪体内的分布和表达情况,结果表明GRP蛋白在猪组织中具有广泛的分布表达,表明GRP在猪体内可能具有多种生理功能。该论文进一步研究GRP对猪睾丸间质细胞睾酮的分泌和合成的影响,结果表明一定浓度的GRP能够促进睾酮分泌并调节睾酮合成相关蛋白的表达;另外,研究结果还表明一定浓度的GRP对睾丸间质细胞的细胞增殖和凋亡也有影响;并发现GRP/GRPR系统对睾丸间质细胞的调节作用可能是通过pPKC/PKC途径。
段香媛[2]（2021）在《蜂王浆主蛋白2抑制幼虫芽孢杆菌的机理分析及体外重组表达》文中进行了进一步梳理美洲幼虫腐臭病（American foulbrood,AFB）是由幼虫芽孢杆菌（Paenibacillus larvae subsp.Larvae,P.larvae）引起的一种易感染、易传播且极具破坏性的细菌病,主要发生在西方蜜蜂的（Apis Mellifera L.）各个亚种,呈世界性分布。AFB的临床治疗主要依靠抗生素,由此引发了细菌产生抗药性和蜂产品抗生素残留的问题,寻找和开发新型抗生素替代物十分必要。蜂王浆（Royal jelly,RJ）是由工蜂咽下腺和上颚腺分泌的一种浆状物质,蛋白质是蜂王浆的主要功能成分,主要由蜂王浆主蛋白（Major royal jelly proteins,MRJPs）组成,其中蜂王浆主蛋白2（Major royal jelly protein2,MRJP2）是MRJPs中第三大成分蛋白,占MRJPs的16%左右。N-糖基化的蜂王浆主蛋白2（N-MRJP2）可以抑制幼虫芽孢杆菌,但是其抑菌机制仍不清楚。在此,通过分析N-MRJP2处理后P.larvae的细胞膜通透性改变及细菌蛋白质组的变化来揭示抑菌机制,并用杆状病毒昆虫细胞表达系统表达并纯化MRJP2。利用基因定点突变技术对MRJP2的N145-糖基化位点进行突变（N突变为Q）,获得该位点失去糖基化修饰的重组N145Q-MRJP2。P.larvae具有不同的基因型,不同的基因型在毒力和致病性方面存在差异。首先,通过Rep（repetitive Extragenic Palindromic,基因外重复回文系列）PCR技术和碱性磷酸酶活性检测技术,对实验中用到的P.larvae进行基因型的鉴定,结果显示该P.larvae基因型为最常见且极具危害性的ERICⅡ型。然后,从蜂王浆中纯化出N-MRJP2,使用最小抑菌浓度法和抑菌圈法测量N-MRJP2的抑菌能力。N-MRJP2处理后,P.larvae培养液260 nm的光吸收值显着提高,说明N-MRJP2会造成P.larvae细胞膜受损,胞内遗传物质DNA&RNA外溢;利用飞行时间二次离子质谱和钙离子荧光探针Fluo 3-AM进一步检测处理前后胞内钙离子（Ca2+）浓度的变化,结果发现,处理后P.larvae胞内Ca2+浓度显着提高,说明N-MRJP2处理能显着改变P.larvae细胞膜的通透性。膜蛋白质组比较结果显示,与P.larvae细胞壁合成、孢子萌发和能量生成等通路相关的蛋白质表达水平显着下降,而与转运、压力应对相关的蛋白质表达水平显着上升。N-MRJP2处理能够增加P.larvae细胞膜的通透性;同时,能量生成、细胞壁合成和细胞分化受阻,最终阻碍呼吸并诱导细胞程序化死亡从而实现N-MRJP2对P.larvae的抑制活性。最后,为了解决王浆主蛋白家族成员同源性高、理化性质接近、分离纯化困难的问题,我们利用杆状病毒昆虫细胞表达系统,成功构建了杆状病毒MRJP2-Bacmid质粒并转染Sf9昆虫细胞。为了进一步分析不同糖基化修饰位点对MRJP2功能的调节作用,利用基因定向突变技术,对MRJP2的N145糖基化位点进行突变（N突变为Q）,构建了N145Q-MRJP2-Bacmid重组质粒并转染Sf9昆虫细胞,包装病毒并表达目的蛋白。通过柱层析和离子交换纯化得到重组蛋白,SDSPAGE、Western blotting及质谱验证结果显示重组蛋白表达正确且纯度较高。本研究初步解析了N-MRJP2抑制P.larvae的作用机制,为N-MRJP2这一具有抗菌潜力的新型天然抗菌物质的开发利用奠定基础。同时,利用杆状病毒昆虫细胞表达系统对MRJP2及N145Q-MRJP2成功表达和分离纯化,有利于进一步分析MRJP2的结构及功能。
张瑶[3]（2021）在《裂解酶P26ly对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌生物被膜清除作用的研究》文中研究指明生物被膜是由蛋白质、DNA和多糖组成的被基质包裹的细菌聚集性结构群落。与浮游生物相比,生物被膜对各种抗生素的耐药性要高出10～1000倍,并且几乎所有的微生物在形成生物被膜后,对绝大多数抗生素具有较强的耐药性。噬菌体裂解酶是噬菌体在感染细菌后期表达的一类细胞壁水解酶,对多种细菌均有杀菌作用且不易产生耐药性,能抑制生物被膜的形成并加以降解清除,使之有望成为新型的抗菌物质。本文以通过宏病毒组测序获得的裂解酶基因P26ly序列为基础,利用PCR扩增方法鉴别出含有此基因的噬菌体株,并研究该噬菌体的生物学特性,同时对裂解酶基因P26ly进行了克隆表达,研究裂解酶对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果,并探索其对生物被膜的清除作用。结果表明,裂解酶基因P26ly对应的噬菌体为SP26,该噬菌体属于有尾噬菌体目,长尾噬菌体科,在pH为5～8,温度为4～40℃时活性较高。裂解酶P26ly分子量为17 k Da,最适酶活温度和pH值分别为37℃和7.5,Mg2+、K+离子对酶有激活作用,裂解酶浓度为75μg/mL时能够裂解宿主菌细胞壁,并对多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有良好的杀菌作用。裂解酶P26ly浓度为75μg/mL时,其分别与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌株共孵育后,未形成明显的生物被膜状,菌体分散、密度低,能够有效抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物被膜的形成。其分别与已形成生物被膜的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌共孵育后,通过XTT法结合荧光染色观察,可以发现生物被膜中的被膜菌的活菌数显着降低;扫描电镜结果显示,裂解酶P26ly作用后生物被膜的细胞被破坏,引起细胞质内容物溶出,并导致细胞变形。说明裂解酶对生物被膜具有较好的清除作用。进一步将裂解酶P26ly与抗生素阿莫西林联合使用后,发现生物被膜的清除效果更佳,说明两者联用的杀菌效果比单独使用更显着。综上所述,裂解酶P26ly能够有效抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物被膜的形成,同时对已经形成的生物被膜有降解作用。裂解酶P26ly与抗生素阿莫西林联用后,能够降低抗生素的使用量。表明裂解酶P26ly有望成为新型的抗菌物质,本研究为抗生素的替代技术提供了一个新的思路。
张凡庆[4]（2020）在《猪源抗猪腹泻重要病原体单链抗体及其保护作用研究》文中提出仔猪腹泻占新生仔猪总死亡率的50%以上,是对养猪业造成经济损失的重要疾病之一。目前临床常见的仔猪腹泻病原包括猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus,TGEV）和产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）。发病仔猪表现为腹泻、脱水、生长迟缓和最终死亡。PEDV和TGEV的预防措施是将疫苗免疫母猪,初生仔猪吸吮乳汁被动获得抗体。然而疫苗不能使所有母猪产生高水平乳源抗体,每头仔猪吮乳时间长短不同,很难保证仔猪都获得足够抗体抵抗病毒感染。ETEC的防控依靠抗生素,然而抗生素的大量使用容易导致ETEC产生耐药性。鉴于此,寻求有效对抗这些病原感染的新型免疫制剂显得极为重要。对于消化道病原感染,给动物口服特异性抗体或抗体衍生物是有效的防治方式。然而传统的抗体制剂存在均一性差、抗体来源与受治动物种属不同易产生免疫排斥等问题。随着生物技术的发展,基因工程抗体成为新型抗体制剂的研究热点,基因工程抗体中最具代表性的是单链抗体（single-chain fragment variable,scFv）。人类医学领域有关scFv治疗疾病的研究已很成熟,兽医领域的相关研究则刚刚开始,特别是猪源性scFv的研究以及scFv防治猪腹泻病原的感染鲜有报道,而这方面的研究对猪腹泻病原体新型防治策略的研发具有重要意义。基于此,本研究构建了猪源噬菌体-scFv库,筛选了抗猪源腹泻病原体（PEDV、TGEV和ETEC）scFv,并研究了scFv的生物学特性和保护作用。研究内容包括五个方面:1猪源性抗猪腹泻重要病原体scFv的获得为了获得抗猪腹泻重要病原体scFv序列,构建了猪源噬菌体-scFv库,库容量为5.5×107 cfu/m L(VH-Linker-VLκ)和7.2×107 cfu/mL（VH-Linker-VLλ）。从库中随机挑取12个克隆测序,证实构建的库来源于猪抗体序列,具有多样性。分别以PEDV、TGEV全病毒以及提纯的ETEC K88ac菌毛作为抗原,对构建的猪源噬菌体-scFv库进行筛选,获得了3株高亲和力的抗PEDV scFv（PZZ 21、PZZ 24和PZZ 35）、4株抗TGEV scFv（TZZ 14、TZZ 19、TZZ 43和TZZ 46）以及2株抗ETEC K88ac scFv（EZZ 3和EZZ 24）。将scFv序列进行原核表达及纯化,获得了具有活性的可溶性蛋白。这些猪源scFv应用于仔猪时避免了因抗体与受治动物种属不同而造成机体对抗体产生免疫排斥。2 scFv的生物学特性研究2.1抗PEDV和TGEV scFv的生物学特性研究为了研发抗PEDV和TGEV的新型scFv口服制剂,对针对PEDV和TGEV scFv的生物学特性进行研究。稳定性试验发现4℃保存时添加蛋白酶抑制剂延长了scFv的活性。亲和力试验证实这些scFv的亲和力均在107-108 M-1。分析scFv结合的病毒蛋白,发现PZZ 21、PZZ 24和PZZ 35均与PEDV S蛋白的S1亚基结合,TZZ 14、TZZ 19和TZZ 46与TGEV S蛋白结合,TZZ 43与TGEV N蛋白结合。病毒中和实验证实上述针对S蛋白的scFv具有抗病毒效果,而且将PZZ21、PZZ 24和PZZ 35联合使用的抗病毒效果好于单个scFv,TZZ 14、TZZ 19和TZZ 46也显示出协同作用。分析scFv影响PEDV感染细胞的阶段,发现PZZ21、PZZ 24和PZZ 35在病毒结合细胞时发挥抗病毒作用,而在入侵阶段无作用。2.2抗ETEC K88ac菌毛scFv的生物学特性研究ETEC K88ac菌毛介导细菌对肠上皮的黏附,是引起腹泻的先决条件。细胞黏附抑制实验证实抗ETEC K88ac的scFv EZZ 3和EZZ 24能抑制ETEC黏附IPEC-J2细胞,抑制率达51.9±2.7%和46.7±2.1%,EZZ 3和EZZ 24联合使用对细菌的黏附抑制率达62.6±1.5%。进一步建立了ETEC感染小鼠的腹泻模型,使用该模型分析了EZZ 3和EZZ 24对小鼠的保护作用。结果发现,与ETEC攻毒组相比,scFv处理组小鼠感染ETEC后仅表现轻度腹泻症状,肠道结构完整。此外scFv口服不会造成小鼠组织细胞损伤,不影响小鼠生长,具有安全性。3壳聚糖纳米scFv口服制剂的研制虽然上述研究证明抗PEDV和TGEV scFv在体外中和病毒感染,抗ETEC scFv对ETEC引起的小鼠腹泻具有保护作用,但仔猪消化道环境复杂,抗体口服后可能会受到胃部酸性环境和蛋白酶影响导致疗效降低。为了提高scFv在仔猪胃肠道稳定性,本研究以羧甲基壳聚糖为原料制备了p H响应性scFv纳米口服制剂（CMCS/CS-scFv）。通过优化投入比例和反应条件,得到的CMCS/CS-scFv粒径为292±21 nm,PDI为0.24±0.12。CMCS/CS-scFv纳米制剂眼观呈光泽的乳白色,透射电镜下呈现球形,大小均一。CMCS/CS-scFv能抵抗胃酸对scFv的破坏,其释放具有p H响应性,酸性环境下少量释放,碱性环境中快速释放。此外CMCS/CS-scFv对肠道细胞和仔猪没有毒性,具有安全性。本研究为开发scFv口服制剂的新剂型提供了科学依据。4纳米口服制剂CMCS/CS-scFv对仔猪病原性腹泻的保护作用研究为了验证CMCS/CS-scFv对仔猪腹泻的保护功能,首先比较了scFv和CMCS/CS-scFv对仔猪感染单一病原体的保护效果。PEDV的仔猪保护实验发现,CMCS/CS-PZZ（PZZ包括scFv PZZ 21、PZZ 24和PZZ 35）和PZZ灌服后对仔猪感染PEDV具有保护作用,而且CMCS/CS-PZZ处理后仔猪的腹泻指数显着低于口服PZZ（p<0.05）,显示出更好的保护效果。TGEV动物实验也证实CMCS/CS-TZZ（TZZ包括scFv TZZ 14、TZZ 19和TZZ 46）处理组对仔猪腹泻的保护效果好于TZZ处理组,粪便病毒载量显着低于TZZ处理组（p<0.05）。ETEC动物实验证实CMCS/CS-EZZ对仔猪感染ETEC提供保护,而且CMCS/CS-EZZ口服后保护效果好于EZZ。针对仔猪腹泻往往是多个病原混合感染,将CMCS/CS-scFv（包括PZZ、TZZ、EZZ）联合应用,发现CMCS/CS-scFv灌胃后粪便中病毒粒子和细菌数量显着低于攻毒组（p<0.05）,存活率高于攻毒组,说明CMCS/CS-scFv联合应用对病原混合感染具有保护效果,为临床大规模应用和制剂优化奠定了基础。5分泌表达scFv的乳酸乳球菌对仔猪病原性腹泻的保护作用研究scFv治疗仔猪腹泻时,其在肠道存留时间越长效果越好,为了使scFv在肠道持续释放,受乳酸菌活载体疫苗的启发,将抗猪腹泻病原体scFv与乳酸乳球菌（Lactococcus lactis,L.lactis）表达系统结合,构建了分泌表达scFv的重组L.lactis-scFv（scFv包括PZZ 21、TZZ 19和EZZ 3）。体外实验测定了重组L.lactis-scFv的酸碱耐受性,体内实验证实重组L.lactis-scFv靶向定殖在仔猪肠道黏膜并分泌scFv。细胞保护实验证实了分泌的抗病毒scFv对PEDV、TGEV的中和效果,抗K88ac scFv对ETEC黏附细胞的抑制作用。动物保护实验证实重组L.lactis-scFv口服后对仔猪感染腹泻病原产生保护作用,PEDV、TGEV或ETEC感染引起的腹泻症状减轻。本研究为治疗仔猪腹泻的新型scFv口服投递系统研发提供了科学依据。综上所述,本研究首先构建了猪源噬菌体-scFv库,从中筛选到具有活性的抗PEDV、TGEV和ETEC K88ac scFv;然后通过细胞实验分析了抗PEDV和TGEV scFv结合的病毒蛋白及中和病毒作用,细胞黏附抑制实验和小鼠保护实验证实了抗ETEC K88ac scFv防治腹泻的功能;进一步研制了抵抗胃部酸性环境和蛋白酶的纳米口服制剂CMCS/CS-scFv,增加了scFv口服稳定性;仔猪保护实验证实了scFv和CMCS/CS-scFv对PEDV、TGEV和ETEC引起的仔猪腹泻均具有保护作用,并且口服CMCS/CS-scFv具有比scFv更好的保护效果;将CMCS/CS-scFv联合应用,证实对仔猪腹泻病原混合感染提供保护;构建了分泌表达scFv的重组L.lactis-scFv,证实了重组L.lactis-scFv口服后对仔猪感染腹泻病原体具有良好的保护作用。本研究为仔猪腹泻病原的防治探索了新的途径,也为其它动物疫病的抗体制剂防治提供了有益借鉴。
王珵珵[5]（2020）在《针对丙型肝炎病毒E2包膜糖蛋白后层结构域开发相应中和抗体》文中认为丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）是一种小型的单股正链带包膜的RNA病毒,系黄病毒科,丙型肝炎病毒属。目前已经鉴定出八种基因型和八十六个亚型。丙型肝炎病毒感染引发不同程度的肝炎,从轻症肝炎,到肝硬化,甚至肝癌。丙型病毒肝炎危机全球3.5亿多人的生活质量,大约40%到95%的丙肝病毒感染者会发展为慢性丙肝病毒感染,即血液中持续存在丙肝病毒RNA。慢性丙肝病毒感染因此成为一个全球性的健康问题。在2016年,世界卫生组织制定全球抗肝炎策略,目标在2030年消除病毒性肝炎对人类健康的威胁。随着对丙肝病毒的结构及其生活周期的深入了解,最新研发的一种多基因型直接抗病毒药物（direct acting antivirals,DAA）的临床应用彻底改变了传统的丙肝治疗。这种靶向HCV编码蛋白的DAA疗法能够治愈90%以上的感染患者,其中包括HCV感染的晚期肝病患者。但是随着病毒耐药性的形成,治疗失败也常有发生。而目前仍存在的困难包括:在低收入国家能获得诊断的人数少,治疗成本高以及没有抗HCV疫苗的问题。因此,研制预防性疫苗是控制全球丙肝病毒感染的必要手段。HCV的E1和E2包膜糖蛋白会在病毒表面形成异质二聚体,通过与宿主细胞受体结合介导病毒的进入。在过去的几十年内,人们在体外表达的E1E2异质二聚体往往质量不高,因而难以对其结构和功能进行研究。基于对HCV包膜糖蛋白的部分已知结构及对比其他黄病毒包膜蛋白特点,推测E2蛋白是经典的融合蛋白,而E1可能是参与融合的蛋白。E2包膜糖蛋白的胞外域是呈球形的非延伸的折叠,并分为不同的两层:包括有前层结构域及中央免疫球蛋白折叠结构域的前层,和后层（Back layer,BL）。有研究发现E1和可溶性E2糖蛋白的后层结构域（soluble E2-Back layer domain,sE2-BLd）之间存在关键相互作用,而sE2-BLd与E1相互作用正参与HCV包膜与细胞膜融合发生显着构象变化的过程中。我们实验室前期实验结果发现HCV包膜糖蛋白sE2-BLd以可溶形式,在HCV进入宿主细胞过程中发挥抑制作用。为研究E2-BLd多肽是否可以作为免疫原引发机体产生中和HCV的免疫反应,我们构建了用于表达E2,E2-BLd的质粒。为优化E2-BLd的表达,我们还对其中未配对的半胱氨酸进行了突变,避免蛋白聚集的形成。将构建的这些质粒转染哺乳动物细胞中表达带有组氨酸标签（histidine-tag,his-tag）的蛋白,发现这些组氨酸标签蛋白难以纯化。因此,为提升蛋白产量,我们构建了带谷胱甘肽巯基转移酶标签（glutathione S-transferase tag,GST-tag）的质粒,用于在大肠杆菌DE3菌株（Escherichia coli DE3/BL21,E.coli DE3/BL21）中表达可溶性重组蛋白,其蛋白产量足够用于建立酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）。之后,我们决定采取直接将质粒电脉冲到小鼠肌肉中表达E2和E2-BLd,这种DNA免疫方法同时具备操作方便和免疫原纯度高的优势。细胞培养扩增的HCV病毒（Cell-culture grown HCV,HCVcc）可用于研究病毒复制过程中吸附和入侵阶段的机制。为了评估E2-BLd抗体对病毒感染的潜在保护效果,我们分离免疫小鼠血清并检测其对HCVcc病毒的中和能力。但未检测到E2和E2-BLd免疫的小鼠产生了具有中和病毒效力的特异性免疫应答。然而,我们采用蛋白免疫印迹实验（Western Blotting,WB）和酶联免疫吸附实验却能检测到小鼠血清中存在能够识别来自HCV病毒H77毒株和J6毒株抗原的特异性抗体。综上所述,我们通过DNA免疫小鼠的方法获得了抗HCV核心蛋白,E2和E2-BLd（来源HCV H77毒株）的多克隆抗体,证实我们的免疫方法有效。为后续研究E2-BLd抗体抑制HCV进入宿主细胞奠定了生物学基础。
陈松彪[6]（2020）在《宿主蛋白SYNCRIP和MCM3在猪细小病毒复制过程中作用及机制研究》文中研究说明猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）是引起母猪繁殖障碍性疾病重要病原,能够引起初孕母猪流产、产死胎、畸胎和木乃伊胎等,给养猪业造成了巨大的经济损失。PPV基因组主要包括2个开放性阅读框（Open Reading Frame,ORF）ORF1和ORF2,ORF1主要编码非结构蛋白NS1和NS2,它们的功能是参与病毒复制及致细胞病变。NS2具有与NS1相同的N末端,且NS2-m RNA是由NS1-m RNA（pre-m RNA,NS2-m RNA的前体m RNA）经可变剪接之后产生。宿主蛋白Syncrip是核不均一核糖核蛋白（Heterogenous nuclear ribonucleo proteins,hn RNPs）家族成员之一,与宿主细胞m RNA的转录、外显子剪接以及剪接位点的选择等过程相关,此外还参与了某些肝炎病毒的复制。ORF2主要编码结构蛋白VP1和VP2,VP2是PPV最主要的衣壳蛋白,占衣壳成分的80%左右,在病毒感染过程中VP2参与了病毒基因组的入核和成熟病毒粒子的组装。宿主蛋白MCM3是解旋酶MCM家族成员之一,在宿主DNA复制过程中能够使双链DNA发生解旋从而促进宿主细胞DNA的复制。然而,在PPV复制过程中宿主蛋白Syncrip和MCM3有何作用及其作用机制,迄今尚未见报道。本论文首先构建编码NS1和NS2共有基因序列的大肠杆菌表达载体,制备能同时识别出NS1和NS2的多克隆抗体。通过无缝克隆技术（In-Fusion）构建稳定携带遗传标记的PPV全长感染性克隆株。然后,利用蛋白-蛋白免疫共沉淀（Co-IP）以及RNA-蛋白免疫共沉淀（RNA-pulldown）串联质谱技术分别筛选出NS1-m RNA和VP2关键宿主互作蛋白Syncrip和MCM3。最后,研究宿主互作蛋白Syncrip和MCM3在PPV复制过程中的作用及机制,为进一步探索PPV致病机制奠定理论基础。研究取得以下结果。1.PCR扩增出编码NS1和NS2共有的ns基因,将扩增出的ns基因克隆入原核表达载体p ET-32a,PCR、酶切和测序鉴定结果显示,p ET-32a-NS原核表达载体构建成功。将p ET-32a-NS转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）中进行诱导表达,SDS-PAGE和western blotting结果显示,重组质粒在大肠杆菌中成功表达出大小为35 k Da左右的NS重组蛋白,并且该重组蛋白在上清和包涵体中均有表达。对重组菌可溶性表达的最佳条件进行优化,结果显示,重组菌在37℃,0.8 m M诱导剂诱导6 h时的可溶性表达量最高。在最佳条件下大量诱导表达重组蛋白,通过His镍柱纯化出NS重组蛋白。将纯化的重组蛋白免疫小鼠制备抗NS蛋白血清抗体,ELISA检测抗体效价为1:12800,western blotting检测结果显示,该抗体能够特异性识别原核表达NS重组蛋白以及真核细胞表达的NS1和NS2。2.人工合成基因组两端的特殊回文序列F1和F2,构建含F1和F2序列的质粒p KQLL（F1+F2）。以提取的PPV DN A为模板,分别扩增F3和F4片段,与线性化处理的质粒p KQLL（F1+F2）进行无缝克隆（In-fusion）连接,构建携带遗传标记的PPV全长感染性克隆质粒p Y-PPV,将p Y-PPV质粒转染PK-15细胞,连续盲传进行病毒拯救。提取被感染细胞的DNA进行病毒核酸PCR检测呈阳性,在电镜下观察到了病毒粒子,western blotting和间接免疫荧光（IFA）检测到病毒蛋白的表达,并且连续盲传至15代仍然能检测到病毒所携带的遗传标记。以上结果表明,成功拯救出稳定携带遗传标记的PPV感染性克隆株,命名为Y-PPV株。将Y-PPV和亲本毒株PPV按照相同MOI接种PK-15细胞,通过测定感染后不同时间点病毒DNA拷贝数和TCID50,检测Y-PPV和亲本毒株PPV的复制能力。同时通过AO-EB染色、流式细胞术及caspase活性检测Y-PPV和PPV诱导细胞凋亡的特性。结果显示,Y-PPV的复制能力与亲本毒株相比无显着差异（p>0.05）,同时具备与亲本毒株相似的诱导细胞凋亡特性。进一步将Y-PPV和PPV分别感染初孕母猪,ELISA检测到Y-PPV和PPV感染组初孕母猪血清中PPV抗体水平变化趋势一致且各时间点的PPV抗体水平无明显差异（p>0.05）,放射免疫检测结果显示,Y-PPV和PPV感染组初孕母猪血清中的孕酮水平变化趋势一致且各时间点的孕酮水平无明显差异（p>0.05）。通过Real-time PCR检测到Y-PPV和PPV感染的同一组织中病毒载量无明显差异（p>0.05）。病理组织学检查结果显示,Y-PPV和PPV感染均能够使子宫和卵巢组织出现明显病理学损伤。3.筛选鉴定NS1-m RNA的关键宿主互作蛋白。体外合成生物素标记NS1-m RNA,将其与PK-15细胞核抽提物共孵育,以链霉亲和素磁珠筛选共沉淀蛋白并进行质谱分析,筛选出与NS1-m RNA互作的关键宿主蛋白Syncrip。将生物素标记NS1-m RNA和PK-15细胞核抽提物共孵育,RNA-pulldown检测结果显示,NS1-m RNA和Syncrip存在互作。用Syncrip抗体和PPV感染的PK-15细胞核抽提物共孵育进行蛋白质-RNA免疫共沉淀,结果显示,NS1-m RNA和Syncrip存在互作。在PPV感染PK-15细胞后进行原位杂交,通过激光共聚焦检测结果显示,NS1-m RNA和Syncrip存在共定位。将生物素标记NS1-m RNA和纯化后原核表达的Syncrip进行体外互作试验,凝胶迁移结果显示,NS1-m RNA和Syncrip存在直接互作。4.明确Syncrip在PPV感染过程中的作用及机制。利用syncrip的si RNA处理PK-15细胞后,测定PPV感染细胞上清中的病毒DNA拷贝数和TCID50。结果显示,干扰syncrip的表达能够降低PPV感染过程中的病毒DNA拷贝数和TCID50（p<0.05）。通过CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了syncrip敲除细胞株,检测结果显示,该细胞株的细胞活力和野生型PK-15细胞相比无明显差异（p>0.05）。PPV感染syncrip敲除细胞后发现,syncrip的缺失能够显着降低PPV感染后的DNA拷贝数和TCID50（p<0.05）,并且也能够显着降低NS2的蛋白表达水平和m RNA水平（p<0.05）。同时在Y-PPV平台上构建ns2缺失型毒株,细胞试验结果显示,ns2缺失能够显着降低PPV感染过程中的病毒DNA拷贝数和TCID50（p<0.05）。利用Real-time PCR和western blotting检测到PPV在组织中的复制水平与Syncrip表达水平呈正相关。在体外共转染ns1和syncrip,western blotting和Real-time PCR结果显示,过表达Syncrip能够显着降低NS1的蛋白表达和m RNA表达水平（p<0.05）。在体外共转染ns1上ns2的3’末端的剪接位点突变的Flag-NS1（p C-Mut）和Syncrip,western blotting结果显示,过表达Syncrip对NS1的蛋白表达无明显影响（p>0.05）。5.筛选鉴定VP2的关键宿主互作蛋白。收集PPV感染PK-15细胞后的细胞蛋白,以PPV衣壳蛋白3C9抗体进行免疫共沉淀和质谱分析,筛选出VP2的关键宿主互作蛋白MCM3。将p CI-His-VP2和p CI-Flag-MCM3共转至HEK293T细胞,Co-IP发现VP2和MCM3存在互作。将p CI-His-VP2和p CI-Flag-MCM3质粒共转染或病毒感染PK-15细胞后进行免疫荧光染色分析,在激光共聚焦显微镜下观察到外源性及内源性的VP2和MCM3存在明显共定位现象。进一步在大肠杆菌中分别表达p ET-32a-VP2和p GEX-4T-MCM3蛋白并进行纯化,通过GST-pulldown及His-pulldown均能够检测到VP2和MCM3的互作,并且二者的互作不依赖于PPV感染或其它分子的参与。6.明确VP2及MCM3在PPV复制过程中的作用与机制。用vp2基因si RNA处理PK-15细胞后,测定PPV感染细胞上清中的病毒DNA拷贝数和TCID50,结果显示,干扰vp2的表达能够显着降低PPV感染后的DNA拷贝数和TCID50（p<0.05）。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了mcm3敲除细胞株,检测发现,该细胞株的细胞活力和野生型PK-15细胞相比无明显差异（p>0.05）。细胞感染试验结果显示,mcm3的缺失能够显着降低PPV感染后的DN A拷贝数和TCID50（p<0.05）。通过Co-IP鉴定出VP2的115 aa231 aa是和MCM3互作的关键结构域。进一步通过原位杂交方法在激光共聚焦显微镜下观察到,在PPV感染后NS1、VP2、MCM3以及病毒基因组DNA存在互作。然后通过DNA-pulldown检测到VP2、NS1和病毒基因组DNA存在直接互作关系,而MCM3不能直接和病毒基因组DNA发生互作。通过Co-IP和激光共聚焦检测到NS1不能参与招募MCM3到病毒基因组DNA,而VP2能够直接招募MCM3到病毒基因组DNA。进一步的DNA-pulldown检测到基因组DNA的300nt356 nt是DNA与VP2互作的关键基序区域,突变该互作基序能够完全阻止PPV的复制。本研究制备了特异性强、且能够同时识别PPV非结构蛋白NS1和NS2的多克隆抗体。成功获得了一株具有遗传稳定性、能够与亲本毒株感染相区分,并且保留了和亲本毒株相似生物学特性的PPV感染性克隆株,命名为Y-PPV株。分别筛选到NS1-m RNA和VP2关键宿主互作蛋白Syncrip和MCM3,明确了NS1-m RNA和VP2与关键宿主互作蛋白Syncrip和MCM3的直接互作关系。发现了NS2和Syncrip能够参与PPV的复制过程,敲除syncrip显着降低PPV的复制以及NS2的表达,ns2的缺失同样会显着降低PPV的复制能力。Syncrip的过表达会显着降低NS1的表达,并且该作用位点位于ns1基因上ns2的3’末端的剪接位点。发现了VP2及其互作蛋白MCM3均参与了PPV的复制,PPV感染过程中通过VP2和病毒基因组DNA直接互作招募MCM3至病毒基因组的DNA促进PPV的复制,获得了VP2的115 aa231 aa是与MCM3发生互作的关键结构域。发现了病毒基因组300 nt356 nt是病毒基因组DNA和VP2发挥互作的关键基序,并且该关键基序对PPV复制是必需的。上述研究结果阐明了NS1-m RNA和VP2及其互作蛋白Syncrip和MCM3在PPV复制过程中的作用及机制,为进一步深入探讨PPV致病机制提供理论依据。
顾鹏帅[7]（2020）在《增强染料脱色过氧化物酶TfuDyP在重组大肠杆菌中的催化活性》文中指出目前,染料脱色过氧化物酶家族（Dye-decolorizing peroxidases,DyPs）因能够对多种染料废水进行脱色而备受关注。但是由于受辅基血红素的限制,该类蛋白在异源表达时活性相对较低,因此,尽可能提高酶蛋白与辅基血红素的结合成为关键。本文的研究对象是褐色嗜热裂孢菌（Thermobifida fusca）的染料脱色过氧化物酶（Dye-decolorizing peroxidase from Thermobifida fusca,TfuDyP）,通过与控制大肠杆菌血红素C5合成途径中的关键酶基因共表达,在提高血红素含量的同时,增强酶与辅基血红素的结合,最终提高酶活性。进而选择三种分属于蒽醌类、双偶氮类、三苯甲烷类的难降解染料:活性蓝19、刚果红、溴甲酚绿,探究TfuDyP脱色能力,并选择脱色效果显着的溴甲酚绿作为底物,优化其反应条件。由于在大肠杆菌中异源表达的TfuDyP属胞内酶,酶的获取需经过破碎离心,不利于工业化的应用,因而采用渗透压蛋白Y（OsmY）蛋白作为载体与TfuDyP融合表达,介导重组蛋白TfuDyP的胞外分泌。主要研究内容与结果如下:（1）过表达血红素合成途径关键酶基因对大肠杆菌胞内血红素含量的影响。在大肠杆菌中分别过表达基因:hemA、hemL和hemH,结果显示血红素含量在过表达hemA菌株中明显升高,达到24.2μmol×L-1,而过表达hemL、hemH的菌株血红素含量无明显变化。将hemA分别与hemL、hemH共表达,结果发现共表达之后的血红素含量与过表达hemA的相比并未提高,反而有所下降。（2）共表达hemA和TfuDyP基因对TfuDyP酶活性的影响。卟啉类化合物在400～405 nm处有明显特征吸收峰,对诱导后各菌液中卟啉类化合物的含量定性分析发现共表达菌株pAD在400～405 nm处的最大吸收值达0.342,高于菌株pD吸收值0.126。对pD菌株血红素浓度测定为3.4μmol×L-1,而菌株pAD中血红素含量明显提高,为9.8μmol×L-1。TfuDyP的蛋白质结合辅基血红素的量可通过408 nm处（Soret值）表示,光谱分析发现,与pD菌株TfuDyP的Soret值0.637相比,pAD菌株为0.794。检测TfuDy P的酶活性显示,菌株pD酶活性为4.5 U×mg-1,而菌株pAD酶活性达到9.2 U×mg-1,提高110%。在pAD菌株中外源添加Fe Cl2、Glu分别将卟啉含量和胞内血红素进一步提高,TfuDyP的酶活性提高至11.8 U×mg-1、13.2 U×mg-1。（3）TfuDyP对溴甲酚绿最适反应条件的优化。以溴甲酚绿染料为研究对象,结果显示其较适宜反应温度、pH、反应时间、酶添加量及溴甲酚绿的质量浓度分别为:25℃、4.5、60 min、40 U×L-1和80 mg×L-1。（4）重组蛋白TfuDyP的胞外分泌表达。通过选择OsmY蛋白作为融合载体与TfuDyP进行融合,介导大肠杆菌重组蛋白TfuDyP的胞外分泌表达。结果显示,Osm Y蛋白与TfuDyP在大肠杆菌内成功融合表达,在100 mL LB液体培养基经12 h诱导后,胞外上清中融合蛋白酶活为5.7±0.25 U×L-1。
白琴琴[8]（2020）在《ZIKA病毒关键免疫原蛋白的制备及DNA疫苗的初步研究》文中研究表明ZIKA病毒是一种蚊媒传播的黄病毒,自2007年起在全球范围内相继发生了几起大规模的ZIKA病毒感染的疫情,尽管大多数患者病毒感染症状较轻,但依然有部分案例证明ZIKA病毒感染与胎儿小头畸形、格林巴利综合症有关,已成为国际关注的公共卫生事件。目前ZIKA病毒感染既没有有效治疗的方法,又没有供临床使用的疫苗。因此应对ZIKA病毒感染的策略主要集中在预防感染,研发一种安全有效的疫苗此时就显得格外重要。包膜糖蛋白即E蛋白,是ZIKA病毒三种结构蛋白之一,其生物学功能是参与受体的结合、膜融合以及宿主免疫识别的主要成分。E蛋白常作为开发针对ZIKA病毒感染的保护性抗体时的靶向蛋白。本实验的目的主要是表达纯化ZIKA病毒E蛋白,并用特异性抗体检测蛋白是否具有免疫原性。扩增E蛋白膜外区基因并克隆到原核表达载体pET-28a上,成功构建了原核重组质粒pET-28a-ZIKA-E80,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导后,蛋白以包涵体的形式表达在沉淀中。先用8M尿素对包涵体进行变性后,再镍柱亲和层析纯化变性蛋白,得到纯度较高的重组蛋白,后又通过浓度梯度透析法缓慢去除变性剂使蛋白复性。用纯化后的重组蛋白作抗原,用针对E蛋白的特异性抗体作一抗,进行Western-blot检测,结果显示纯化蛋白具有免疫原性。膜前体蛋白即prM/M蛋白,是ZIKA病毒另一种结构蛋白,目前已知生物学功能是E蛋白前期加工运输时防止过早融合,后期帮助E蛋白折叠形成同型二聚体。prM/M蛋白在ZIKA病毒疫苗研制过程中常被作为抗体激活表位。本实验主要是选择合适的M蛋白编码序列进行原核质粒构建,并对表达的ZIKA病毒M蛋白进行纯化。先扩增全段M蛋白基因并整合到原核表达载体pET-28a上,成功构建了原核重组质粒pET-28a-ZIKA-M,但发现这一重组质粒无法在大肠杆菌中表达M蛋白,后又以此质粒为模板PCR扩增去除编码M蛋白跨膜区的序列,最终成功构建重组质粒pET-28a-ZIKA-M90,转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后,蛋白以包涵体的形式表达在沉淀中。采用与E蛋白同样的纯化方法最终得到了纯的ZIKA病毒M蛋白。本实验首先将含有编码ZIKA病毒prM/E蛋白序列的真核重组质粒pCMV-S-ZIKAME转染到小鼠肌肉组织中,用肌肉组织作蛋白样,以E蛋白的特异性抗体为一抗,进行Western-blot检测,结果显示重组质粒pCMV-S-ZIKAME在肌肉细胞中能够表达抗原蛋白prM/E蛋白。然后用PEI作免疫佐剂,采用雾化的方式将质粒pCMV-S-ZIKAME免疫小鼠,三次免疫后对小鼠摘眼球取血,并以纯化的prM/E蛋白作抗原,以小鼠血清作抗体进行Western-blot反应,最终结果显示小鼠血清具有特异性抗体,初步说明重组质粒pCMV-S-ZIKAME在体内表达后能引起机体的免疫反应。
黄爱国[9]（2020）在《靶向对虾白斑综合征病毒纳米给药系统研究》文中研究指明对虾白斑病（White Spot Disease,WSD）是由白斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV）感染虾类致病的病毒性疾病,具有发病急、死亡率高等特点。虾类等无脊椎动物不具备适应性免疫系统,药物治疗和无特定病原（Specific Pathogen Free,SPF）苗种生产是防控WSD的有效手段。目前,尚无商品化药物控制WSD,开发抗WSSV药物十分必要。传统的虾类SPF苗种因培育周期长和成本高等因素,严重限制其推广应用。中草药具有资源丰富、环境友好、易降解等优点,是安全无公害水产原料药的理想来源。纳米靶向给药系统具有极易穿透组织屏障、靶向给药和提高药物疗效等优点,在提高药物疗效和高效制备SPF苗种研究方面具有重大意义。本研究以感染WSSV的克氏原螯虾为模型,从中草药中筛选抗WSSV活性的种类,并进一步对其主要活性成分进行抗WSSV活性评价和机制研究。在此基础上,选择单壁碳纳米管（SWCNTs）作为纳米载体,通过化学合成方法先后连接抗WSSV化合物和能够特异性识别WSSV的单链抗体,制备为纳米靶向给药系统,并于在体条件下,评价该系统抗WSSV效果。本研究取得结果如下:1. 中草药抗WSSV活性筛选利用实时荧光定量PCR和建立的绝对定量WSSV基因组拷贝数标准曲线,检测WSSV在克氏原螯虾体内的动态变化,结果显示:WSSV能够不同程度地感染克氏原螯虾鳃、血淋巴、后肠、肌肉和肝胰腺;其中,鳃组织中WSSV含量最高,而肝胰腺中WSSV含量最低;WSSV在克氏原螯虾体内的增殖曲线是典型的病毒一步生长曲线;WSSV极早期基因ie1、早期基因dnapol和晚期基因vp28的表达趋势与基因组DNA复制趋势一致。利用WSSV感染的克氏原螯虾为试验模型,对30种中草药粗提物进行抗WSSV活性筛选,结果发现处理浓度为100 mg/kg的栀子、杜仲、巴戟天、刺五加、黄精物、吴茱萸和白头翁的粗提物能够显着地抑制WSSV基因组复制,抑制率分别为92.31%、78.65%、69.00%、64.50%、62.01、57.87%和46.58%。2. 栀子粗提物抗WSSV活性研究利用WSSV感染的克氏原螯虾为试验模型,评价栀子粗提物抗病毒效果,结果发现:栀子粗提物呈浓度依赖性地抑制WSSV基因组复制;当处理浓度为100 mg/kg时,栀子粗提物对WSSV基因组复制抑制率高达90%以上;栀子粗提物能够显着抑制WSSV极早期基因ie1、早期基因dnapol和晚期基因vp28的表达;栀子粗提物（100mg/kg）处理7 d后,患病克氏原螯虾的累积存活率提高了60%。此外,栀子粗提物可以提高感染WSSV克氏原螯虾鳃组织中抗氧化相关基因（c Mnsod、m Mnsod、cat和gst）和凋亡相关基因（bax和bax inhibitor-1）的表达。利用液质联用仪,检测栀子粗提物中的京尼平苷（GP）、京尼平苷酸（GPA）和京尼平（GN）的含量,结果发现GP、GPA和GN的含量分别为171.93 mg/g、1.25 mg/g和0.46 mg/g。3. 栀子3种活性成分抗WSSV活性研究利用WSSV感染的克氏原螯虾为模型评价GP、GPA和GN的抗WSSV活性,结果发现:GP、GPA和GN能够显着抑制WSSV复制,而且处理浓度为50 mg/kg时抑制率均超过90%;使用浓度均为50 mg/kg的GP、GPA和GN分别处理10 d后,患病克氏原螯虾的累积存活率分别提高了70.0%、43.33%和50.0%。利用WSSV感染的南美白对虾为模型评价GP、GPA和GN的抗WSSV活性,结果显示:当处理浓度为50mg/kg时,这3种化合物对WSSV复制的抑制率均超过90%。GP、GPA和GN能够保护克氏原螯虾免遭氧化损伤和炎症反应。药代动力学研究表明:GP和GPA在克氏原螯虾和南美白对虾的体内的药代曲线相似;肝胰腺中药物含量最高,鳃组织中含量最少。4. GP、GPA和GN对WSSV蛋白功能的作用研究通过研究GP、GPA和GN对WSSV增殖的影响,结果发现这3种化合物主要影响WSSV复制早期阶段。通过构建WSSV囊膜蛋白VP19、VP24、VP26和VP28的真核质粒,经过细胞转染、荧光显微镜观察,结果显示:GP、GPA和GN有效地抑制VP19、VP24、VP26和VP28质粒在果蝇S2细胞内的表达,其中GN对VP28的抑制效果最为显着,表明这3种化合物能够作用于WSSV囊膜蛋白,进而对WSSV囊膜蛋白的表达和功能产生影响。GP、GPA和GN能够抑制STAT基因的表达,进而抑制极早期基因ie1、早期基因dnapol的转录,最终抑制WSSV的复制和晚期基因vp28的表达。5. 靶向WSSV纳米给药系统构建及效果评价通过基因重组技术构建特异识别WSSV的单链抗体P75E8的原核表达质粒和菌株。利用发酵和纯化等技术制备P75E8蛋白。Elisa检测表明P75E8蛋白与WSSV具有较高亲和力。细胞共转染试验发现,PE5E8从细胞核迁移至细胞质与WSSV囊膜蛋白VP28结合。酵母双杂交和Western blot结果表明,P75E8与VP28互作位点位于VP28460-612区域内。选取GPA、P75E8和SWCNTs分别作为抗WSSV药物、靶向配体和纳米载体,构建纳米靶向给药系统（SWCNTs-GPA-P75E8）。利用WSSV感染的克氏原螯虾模型,对GPA、SWCNTs-GPA和SWCNTs-GPA-P75E8进行抗病毒效果评价,结果发现SWCNTs-GPA-P75E8具有最强的抗WSSV活性。当用浓度为25 mg/kg的药物处理10 d时,GPA、SWCNTs-GPA和SWCNTs-GPA-P75E8处理组的患病克氏原螯虾的存活率分别为23.33%、36.67%和46.67%。药代动力学研究表明,SWCNTs-GPA-P75E8处理组的克氏原螯虾鳃组织中GPA含量显着高于GPA和SWCNTs-GPA处理组,而且减缓了药物代谢时间。浸浴处理南美白对虾仔虾的试验结果表明,GPA、SWCNTs-GPA和SWCNTs-GPA-P75E8能够不同程度的杀灭仔虾体内WSSV病毒,而且SWCNTs-GPA-P75E8的抗病毒效果显着高于GPA和SWCNTs-GPA。综上所述:栀子能够抑制WSSV复制,减少感染病毒克氏原螯虾的死亡率;栀子活性成分GP、GPA和GN能够通过间接抗病毒反应和直接作用病毒囊膜蛋白,发挥抗WSSV作用,具备开发为抗WSSV新型药物的潜力;纳米靶向给药系统能够通过靶向病毒蛋白VP28,实现WSSV的靶向治疗,提高药物的抗病毒效果,为高效抗WSSV和虾类SPF苗种生产提供一定的理论依据。
王瑞明[10]（2018）在《鸭坦布苏病毒核酸斑点杂交方法的建立及E蛋白的原核表达》文中进行了进一步梳理鸭坦布苏病毒病（Duck Tembusu Virus Disease,DTVD）为一种由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）引起的传染病,鸭感染该病后主要表现出发育缓慢、产蛋率下降和瘫痪等特征。坦布苏病毒（Tembusu virus,TMUV）属于黄病毒科、黄病毒属、恩塔亚病毒群,它对包括人类在内的哺乳动物具有潜在的健康威胁。建立快速、特异、敏感的TMUV诊断方法,研发高保护效力的新型疫苗,是防控该病流行的有效措施之一。本研究首先建立了基于TMUV NS5基因的核酸斑点杂交方法,该方法特有良好的特异性和灵敏度。随后,使用该方法对疑似病料进行检测,并在检测结果为阳性的病料中分离到一株TMUV毒株SD1601。最后,构建了TMUV E蛋白原核表达质粒,通过大肠杆菌表达系统获得了GST-E融合蛋白。1.TMUV核酸斑点杂交方法的建立本研究根据病毒NS5基因序列,利用地高辛制备DNA探针,建立了TMUV病毒的核酸杂交检测方法。运用Primer 5.0软件设计引物,使用地高辛标记试剂盒,通过PCR扩增制备NS5基因核酸探针。结果表明,本研究所建立的基于NS5的核酸斑点杂交方法具有良好的特异性和灵敏度。该方法可特异性检出TMUV核酸,对DPV、AIV、NDV等常见病毒核酸样品呈阴性;其最低检出量为10pg,高于常规RT-PCR方法。随后,本研究收集40份山东省内种鸭场疑似TMUV感染病料,使用本研究建立的核酸斑点杂交方法进行检测,共检测到4份阳性样品,结果与经典RT-PCR方法一致。本研究所建立的核酸斑点杂交方法为DTVD的防控和流行病学调查奠定了基础。2.TMUV SD1601株的分离与鉴定及其全基因组碱基序列的分析取斑点杂交检测阳性的病料,研磨过滤后接种到BHK-21细胞,经鉴定分离得到一株TMUV野毒株,将其命名为SD1601株。通过扩增SD1601株的全基因组序列并对其进行分析,结果表明,SD1601株病毒的基因组中含有开放阅读框,并且其基因组大小为10990nt,编码的一个多聚蛋白是通过3426个氨基酸构成的。把SD1601株与参考毒株的TMUV的全基因组序列进行核苷酸的同源性与遗传进化树的比较分析,系统发育进化树显示,该毒株属于Ia分枝,SD1601与本研究选取的不同参考株序列的同源性高达96.9%-99.4%。其中,TMUV SD1601株与JS804株和BYD-1株的核苷酸序列同源性最高,为99.4%;与HZ3-2015同源性最低,仅96.9%。E蛋白氨基酸同源性比对结果表明,SD1601株蛋白与SDHS、SDMS、TA2010三个毒株E基因编码蛋白的同源性最高,与早期分离到的经典毒株亲缘关系较远。SD1601株的分离鉴定为进一步了解TMUV的遗传进化提供了理论依据。3.TMUV SD1601株E蛋白的原核表达扩增TMUV SD1601全长E基因,并将其克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,鉴定正确后将其转化受体菌E.coli BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导进行表达并通过SDS-PAGE电泳分析表达蛋白的可溶性。通过改变诱导时间、诱导温度以及IPTG浓度确定最佳诱导条件,通常我们要对可溶性蛋白进行纯化分析可以借助谷胱甘肽凝胶性树脂,并通过western-blot进行验证。结果成功对SD1601的E蛋白进行了表达,诱导表达温度为30℃、IPTG浓度为0.8mM、诱导时间为4h,该重组蛋白同时存在于包涵体和上清中,但是最主要的是在包涵体中。通过上面所介绍的方法我们纯化到了可溶性GST-E蛋白。该蛋白可被抗TMUV的阳性抗体特异性识别。TMUV E蛋白的表达为ELISA检测方法和疫苗等的研制奠定了基础。
二、超声处理对大肠杆菌HCV-NS_3融合蛋白纯化的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、超声处理对大肠杆菌HCV-NS_3融合蛋白纯化的影响（论文提纲范文）
（1）猪GRP多克隆抗体的制备与应用及其对Leydig cells睾酮分泌的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 文献综述: 胃泌素释放肽及其受体与睾丸间质细胞研究进展 |
| 1 胃泌素释放肽及其受体研究进展 |
| 1.1 胃泌素释放肽及其受体的发现 |
| 1.2 胃泌素释放肽及其受体在体内的表达 |
| 1.3 胃泌素释放肽及其受体在体内的功能研究 |
| 1.4 GRP多克隆抗体的制备 |
| 2 睾丸间质细胞研究进展 |
| 2.1 睾丸间质细胞 |
| 2.2 生殖相关激素睾酮 |
| 2.3 睾丸间质细胞的增殖与凋亡 |
| 3 研究目的及意义 |
| 第1章 猪胃泌素释放肽的原核表达及其多克隆抗体的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器和试剂 |
| 1.2 重组载体的构建 |
| 1.3 融合蛋白pGRP的获得 |
| 1.4 多克隆抗体的制备 |
| 2 结果 |
| 2.1 pET32a(+)-pGRP重组载体的构建 |
| 2.2 His-tag-pGRP融合蛋白的获得 |
| 2.3. pGRP多克隆抗体的获得 |
| 3 讨论 |
| 第2章 GRP蛋白在猪体内的分布与表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1仪器和试剂 |
| 1.2 GRP在猪外周组织的分布情况 |
| 1.3 GRP蛋白在猪组织中的表达情况 |
| 2 结果 |
| 2.1 GRP在猪外周组织的分布情况 |
| 2.2 GRP蛋白在猪组织中的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 第3章 GRP对猪睾丸间质细胞睾酮分泌和合成的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器和试剂 |
| 1.2 细胞培养和处理 |
| 1.3 GRP对Leydig cells中GRPR表达的影响 |
| 1.4 GRP对猪Leydig cells睾酮分泌的影响 |
| 1.5 GRP对Leydig cells睾酮合成相关蛋白表达的影响 |
| 1.6 GRP对Leydig cells细胞增殖的影响 |
| 1.7 GRP对Leydig cells凋亡的影响 |
| 1.8 GRP对Leydig cells增殖和凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 1.9 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 GRPR在Leydig cells中的表达情况 |
| 2.2 GRP对猪Leydig cells睾酮分泌及睾酮合成相关蛋白的影响 |
| 2.3 GRP对猪Leydig cells细胞活性的影响 |
| 2.4 GRP对猪Leydig cells细胞凋亡的影响 |
| 2.5 GRP对猪Leydig cells中pPKA/PKA和pPKC/PKC蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）蜂王浆主蛋白2抑制幼虫芽孢杆菌的机理分析及体外重组表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 AFB研究进展 |
| 1.1.1 病原体 |
| 1.1.2 流行病学特征及发病机制 |
| 1.1.3 防控措施及面临的问题 |
| 1.2 蜂王浆抑菌功能的研究进展 |
| 1.2.1 蜂王浆抑菌功能简介 |
| 1.2.2 MRJP2 功能研究进展 |
| 1.3 研究内容及目的意义 |
| 第二章 幼虫芽孢杆菌基因型的鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验样品 |
| 2.1.2 实验试剂及配方 |
| 2.1.3 实验仪器及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Rep-PCR技术 |
| 2.2.2 碱性磷酸酶活性检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 P.larvae Rep-PCR结果 |
| 2.3.2 碱性磷酸酶活性检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 N-MRJP2 抑制幼虫芽孢杆菌机制分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器及耗材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 N-MRJP2 抑菌实验 |
| 3.2.2 紫外吸收物质的测定 |
| 3.2.3 细胞内Ca~(2+)浓度的评估 |
| 3.2.4 幼虫芽孢杆菌膜蛋白的制备 |
| 3.2.5 幼虫芽孢杆菌的膜蛋白质组分析 |
| 3.2.6 膜蛋白丰度非标记定量 |
| 3.2.7 膜蛋白组的生物信息学分析 |
| 3.2.8 Western blotting验证与趋化性相关的蛋白 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 N-MRJP2 具有对P.larvae的抗菌活性 |
| 3.3.2 N-MRJP2 处理诱导P.larvae细胞膜通透性增加 |
| 3.3.3 N-MRJP2 抗幼虫芽孢杆菌膜蛋白组的差异表达分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 MRJP2和N145Q-MRJP2 重组杆状病毒质粒的构建 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验样品 |
| 4.1.2 实验试剂及配方 |
| 4.1.3 实验仪器及耗材 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 总RNA提取及反转录 |
| 4.2.2 ORFs引物设计 |
| 4.2.3 MRJP2 基因扩增、克隆和测序 |
| 4.2.4 pFastBac1-MRJP2 重组质粒的构建 |
| 4.2.5 N145Q-MRJP2 基因扩增、克隆和测序 |
| 4.2.6 MRJP2-Bacmid和 N145Q-MRJP2-Bacmid重组杆状病毒质粒的构建 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 MRJP2 基因扩增与克隆 |
| 4.3.2 p Fast Bac1-MRJP2 重组质粒的构建 |
| 4.3.3 N145Q-MRJP2-p Fast Bac1 质粒的构建 |
| 4.3.4 MRJP2-Bacmid和 N145Q-MRJP2-Bacmid重组杆状病毒质粒PCR鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 重组蛋白的表达及纯化 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验试剂及配方 |
| 5.1.3 实验仪器及耗材 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 MRJP2 重组蛋白的表达 |
| 5.2.2 N145Q-MRJP2 重组蛋白的表达 |
| 5.2.3 MRJP2 重组蛋白的纯化 |
| 5.2.4 MRJP2 重组蛋白的鉴定 |
| 5.2.5 N145Q-MRJP2 重组蛋白的纯化与鉴定 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 病毒的侵染及重组蛋白的表达 |
| 5.3.2 MRJP2 蛋白的纯化及鉴定 |
| 5.3.3 N145Q-MRJP2 蛋白的纯化及鉴定 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新性 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）裂解酶P26ly对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌生物被膜清除作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 细菌生物被膜 |
| 1.1.1 生物被膜的概述 |
| 1.1.2 生物被膜的形成 |
| 1.1.3 生物被膜相关的多重耐药性 |
| 1.1.4 生物被膜的检测方法 |
| 1.1.5 控制生物被膜形成的方法 |
| 1.2 噬菌体裂解酶 |
| 1.2.1 噬菌体概述 |
| 1.2.2 噬菌体裂解酶概述 |
| 1.2.3 噬菌体裂解酶研究现状 |
| 1.2.4 噬菌体裂解酶控制生物被膜的研究现状 |
| 1.2.5 噬菌体裂解酶与抗生素联用的研究现状 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 第二章 噬菌体的生物学特性 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 实验试剂及仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 裂解酶基因P26ly对应噬菌体的筛选 |
| 2.2.2 噬菌体的纯化 |
| 2.2.3 噬菌体的形态观察 |
| 2.2.4 噬菌体的宿主谱 |
| 2.2.5 噬菌体的最佳感染复数 |
| 2.2.6 噬菌体的一步生长曲线 |
| 2.2.7 噬菌体的pH稳定性 |
| 2.2.8 噬菌体的热稳定性 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 裂解酶基因P26ly噬菌体筛选结果 |
| 2.3.2 噬菌体纯化结果 |
| 2.3.3 噬菌体的形态观察 |
| 2.3.4 噬菌体的宿主谱 |
| 2.3.5 噬菌体的最佳感染复数 |
| 2.3.6 噬菌体的一步生长曲线 |
| 2.3.7 噬菌体的pH稳定性 |
| 2.3.8 噬菌体的热稳定性 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 裂解酶P26ly的克隆表达与酶活性验证 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验菌株 |
| 3.1.2 实验试剂及仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 裂解酶P26ly的克隆表达 |
| 3.2.2 重组蛋白的纯化及浓度测定 |
| 3.2.3 裂解酶P26ly的酶活力测定 |
| 3.2.4 裂解酶P26ly的酶学性质测定 |
| 3.2.5 裂解酶P26ly的酶活性验证 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 裂解酶P26ly的克隆表达结果 |
| 3.3.2 重组蛋白的纯化及浓度测定结果 |
| 3.3.3 裂解酶P26ly的酶活力测定结果 |
| 3.3.4 裂解酶P26ly的酶学性质检测结果 |
| 3.3.5 裂解酶P26ly的酶活性验证结果 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 裂解酶P26ly对生物被膜的清除作用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验菌株 |
| 4.1.2 实验试剂及仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 测定不同菌株形成生物被膜的最佳时间 |
| 4.2.2 利用XTT还原法检测被膜菌的活菌数 |
| 4.2.3 利用荧光染色法检测生物被膜生长情况 |
| 4.2.4 生物被膜细胞的扫描电镜观察 |
| 4.2.5 检测裂解酶P26ly与抗生素联用情况 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 不同菌株形成生物被膜的最佳时间 |
| 4.3.2 XTT还原法检测被膜菌的活菌数结果 |
| 4.3.3 荧光染色法检测生物被膜生长结果 |
| 4.3.4 生物被膜细胞的扫描电镜分析 |
| 4.3.5 裂解酶P26ly与抗生素联用结果 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 裂解酶P26ly的杀菌作用 |
| 5.2 裂解酶P26ly对生物被膜的清除作用 |
| 5.3 裂解酶P26ly与抗生素联用情况 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读硕士期间发表论文目录 |
（4）猪源抗猪腹泻重要病原体单链抗体及其保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 仔猪腹泻的防治研究进展 |
| 1.1 PEDV的防治研究进展 |
| 1.2 TGEV的防治研究进展 |
| 1.3 ETEC的防治研究进展 |
| 2 scFv及噬菌体展示技术 |
| 2.1 抗体简介 |
| 2.2 scFv的分子结构 |
| 2.3 scFv的表达 |
| 2.4 scFv的筛选方法 |
| 2.5 scFv的应用 |
| 3 壳聚糖纳米制剂药物口服递送系统概述 |
| 3.1 口服治疗与纳米技术 |
| 3.2 壳聚糖 |
| 3.3 壳聚糖的改性 |
| 3.4 壳聚糖纳米药物载体制备方法 |
| 3.5 壳聚糖纳米制剂在生物医学领域的应用 |
| 4 乳酸菌作为口服递送载体的研究进展 |
| 4.1 LAB |
| 4.2 LAB载体系统 |
| 4.3 NICE表达系统 |
| 4.4 LAB的表达形式 |
| 4.5 LAB表达系统的应用 |
| 5 研究目的与意义 |
| 第二章 猪源噬菌体-scFv库的构建和抗猪腹泻重要病原体scFv的筛选鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒、细胞和菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 猪抗体水平检测 |
| 2.2 外周血淋巴细胞的分离 |
| 2.3 cDNA的合成 |
| 2.4 猪源scFv基因的扩增 |
| 2.5 猪源噬菌体-scFv库的构建 |
| 2.6 猪源噬菌体-scFv库的鉴定 |
| 2.7 PEDV和 TGEV全病毒抗原的制备 |
| 2.8 ETEC菌毛抗原的提取 |
| 2.9 M13KO7 辅助噬菌体的扩增 |
| 2.10 猪源噬菌体-scFv的富集筛选 |
| 2.11 噬菌体ELISA |
| 2.12 重组scFv蛋白的表达及纯化 |
| 2.13 免疫印迹 |
| 3 结果 |
| 3.1 猪抗体水平检测 |
| 3.2 scFv的获得 |
| 3.3 猪源噬菌体-scFv库的构建和鉴定 |
| 3.4 病毒的浓缩纯化 |
| 3.5 ETEC K88ac菌毛的纯化 |
| 3.6 猪源噬菌体-scFv的筛选鉴定 |
| 3.7 噬菌体ELISA鉴定 |
| 3.8 scFv的序列分析与纯化 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 抗猪腹泻重要病原体scFv的生物学功能研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒、细胞和毒株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 抗PEDV和 TGEV scFv的特性分析 |
| 2.2 真核表达质粒的构建 |
| 2.3 细胞转染 |
| 2.4 间接免疫荧光 |
| 2.5 细胞样品处理 |
| 2.6 病毒滴度的测定 |
| 2.7 scFv中和实验 |
| 2.8 scFv对 PEDV入侵Vero细胞的影响 |
| 2.9 抗K88ac菌毛多克隆抗体的制备 |
| 2.10 黏附实验和黏附抑制实验 |
| 2.11 IPEC-J2 细胞的细胞因子测定 |
| 2.12 ETEC感染小鼠腹泻模型的建立 |
| 2.13 抗k88ac scFv对感染ETEC小鼠的保护作用研究 |
| 2.14 小鼠细胞因子水平的检测 |
| 2.15 小鼠肠道病理切片制作及HE染色 |
| 2.16 小鼠肠道病理形态的定量分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 scFv的特异性实验 |
| 3.2 scFv的稳定性分析 |
| 3.3 scFv的亲和力分析 |
| 3.4 scFv的抗原结合位点分析 |
| 3.5 scFv的细胞毒性实验 |
| 3.6 scFv与病毒蛋白的结合 |
| 3.7 scFv的抗病毒作用分析 |
| 3.8 scFv对 PEDV入侵Vero细胞的影响 |
| 3.9 多克隆抗体ELISA效价检测 |
| 3.10 scFv对 ETEC黏附细胞的抑制作用分析 |
| 3.11 scFv对 ETEC诱导细胞因子表达的影响 |
| 3.12 小鼠腹泻模型的建立 |
| 3.13 scFv对小鼠腹泻的保护作用研究 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 壳聚糖纳米口服scFv制剂及其生物学特性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞和实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 CMCS纳米制剂的制备 |
| 2.2 表征分析 |
| 2.3 纳米制剂的包封率及载药量的测定 |
| 2.4 scFv在纳米制剂中的完整性 |
| 2.5 纳米制剂在模拟胃酸环境中的稳定性 |
| 2.6 scFv释放实验 |
| 2.7 纳米制剂的生物安全性实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 CMCS的制备 |
| 3.2 纳米制剂的表征 |
| 3.3 载药率与包封率 |
| 3.4 scFv在纳米材料中的完整性 |
| 3.5 scFv在模拟胃酸环境中的稳定性 |
| 3.6 scFv的释放实验 |
| 3.7 纳米制剂的生物安全性 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第五章 scFv纳米口服制剂CMCS/CS-scFv对仔猪腹泻的保护作用研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 scFv的纯化制备 |
| 2.2 CMCS/CS-scFv和 scFv的口服鉴定 |
| 2.3 CMCS/CS-PZZ对仔猪感染PEDV的保护作用研究 |
| 2.4 CMCS/CS-TZZ对仔猪感染TGEV的保护作用研究 |
| 2.5 CMCS/CS-EZZ对仔猪感染ETEC的保护作用研究 |
| 2.6 scFv纳米制剂联合使用对仔猪感染腹泻病原的保护作用研究 |
| 3 结果 |
| 3.1 口服CMCS/CS-scFv和 scFv在肠道的分布 |
| 3.2 CMCS/CS-PZZ对仔猪感染PEDV的保护作用 |
| 3.3 CMCS/CS-TZZ对仔猪感染TGEV的保护作用 |
| 3.4 CMCS/CS-EZZ对仔猪感染ETEC的保护作用 |
| 3.5 纳米口服制剂CMCS/CS-scFv对腹泻病原体混合感染的保护作用 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第六章 分泌表达scFv的乳酸乳球菌制备及其保护功能研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、细胞和实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 分泌表达scFv 的重组L.lactis-scFv 的构建 |
| 2.2 L.lactis电转化感受态细胞制备 |
| 2.3 L.lactis的电转化 |
| 2.4 重组L.lactis-scFv对模拟胃肠道环境的耐受性及生长曲线 |
| 2.5 重组L.lactis-scFv对 IPEC-J2 细胞的黏附 |
| 2.6 重组L.lactis-scFv对仔猪肠道的黏附 |
| 2.7 重组L.lactis-scFv的诱导表达 |
| 2.8 重组L.lactis-scFv分泌scFv的生物学功能分析 |
| 2.9 重组L.lactis-scFv分泌scFv的动物保护功能分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 scFv分泌表达载体的构建 |
| 3.2 重组L.lactis-scFv的生长特性 |
| 3.3 重组L.lactis-scFv的黏附特性 |
| 3.4 重组L.lactis-scFv分泌scFv的生物学功能鉴定 |
| 3.5 重组L.lactis-scFv的动物保护作用鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 常用溶液的配制 |
| 附录二 补充图 |
| 附录三 补充表 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 授权的发明专利 |
（5）针对丙型肝炎病毒E2包膜糖蛋白后层结构域开发相应中和抗体（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中文部分 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 丙型肝炎病毒的发现 |
| 1.2 丙型肝炎病毒的病原学 |
| 1.2.1 丙型肝炎病毒基因组及病毒蛋白 |
| 1.2.2 丙型肝炎病毒颗粒的结构 |
| 1.2.3 丙型肝炎病毒生命周期 |
| 1.3 丙型肝炎病毒研究中面临的主要困难 |
| 1.4 丙型肝炎病毒E2包膜糖蛋白后层结构域 |
| 1.5 项目概况 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 质粒构建 |
| 2.1.1 质粒及引物的设计与合成 |
| 2.1.2 构建质粒方法 |
| 2.1.3 质粒扩增 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.2.1 细胞株及细胞培养基 |
| 2.2.2 细胞传代 |
| 2.2.3 细胞冻存 |
| 2.2.4 细胞复苏 |
| 2.2.5 构建稳转细胞株 |
| 2.3 蛋白表达与纯化 |
| 2.3.1 细胞转染 |
| 2.3.2 细胞裂解 |
| 2.3.3 蛋白免疫印迹 |
| 2.3.4 抗体 |
| 2.3.5 考马斯亮蓝染色及丽春红染色 |
| 2.3.6 蛋白表达 |
| 2.3.7 蛋白纯化 |
| 2.4 小鼠免疫 |
| 2.4.1 小鼠 |
| 2.4.2 质粒DNA免疫 |
| 2.4.3 丙型肝炎病毒假病毒颗粒包装 |
| 2.4.4 丙型肝炎病毒传染性颗粒的制备 |
| 2.4.5 病毒滴度的测定 |
| 2.4.6 中和实验 |
| 2.4.7 酶联免疫吸附实验 |
| 2.4.8 免疫血清对病毒抗原的识别 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 哺乳动物细胞表达丙型肝炎病毒包膜糖蛋白 |
| 3.1.1 真核表达载体的构建 |
| 3.1.2 构建表达丙型肝炎病毒包膜糖蛋白的稳转细胞株 |
| 3.1.3 丙型肝炎病毒包膜糖蛋白的表达与纯化 |
| 3.2 原核细胞表达丙型肝炎病毒包膜糖蛋白 |
| 3.2.1 原核表达载体的构建 |
| 3.2.2 优化原核表达条件 |
| 3.2.3 原核表达蛋白的制备与纯化 |
| 3.3 制备丙型肝炎病毒 |
| 3.3.1 丙型肝炎病毒假病毒颗粒的包装 |
| 3.3.2 丙型肝炎病毒传染性颗粒的制备 |
| 3.4 小鼠免疫实验 |
| 3.4.1 小鼠免疫程序 |
| 3.4.2 免疫小鼠血清中和感染性丙型肝炎病毒颗粒 |
| 3.4.3 酶联免疫吸附法检测免疫小鼠血清中特异性抗体 |
| 3.4.4 免疫小鼠血清抗体识别病毒抗原 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
| 英文部分 |
| Abstract |
| Chapter1 Introduction |
| 1.1 Discovery of Hepatitis C Virus |
| 1.2 Etiology of Hepatitis C Virus |
| 1.2.1 HCV genomes and viral proteins |
| 1.2.2 Structure of the hepatitis C virus particle |
| 1.2.3 HCV life cycle |
| 1.3 Major Difficulties in HCV Research |
| 1.4 HCV Glycoproteins E2 Back Layer Domain |
| 1.5 Project Overview |
| Chapter2 Materials and Methods |
| 2.1 Plasmids Construction |
| 2.1.1 Constructs analysis and gene synthesize |
| 2.1.2 Plasmids construction |
| 2.1.3 Constructs amplification |
| 2.2 Cell culture |
| 2.2.1 Cell lines and cell culture medium |
| 2.2.2 Cell passage |
| 2.2.3 Cell cryopreservation |
| 2.2.4 Cell thawing |
| 2.2.5 Stable cell line generation |
| 2.3 Protein expression and purification |
| 2.3.1 Transfection |
| 2.3.2 Cell lysis |
| 2.3.3 Western blotting |
| 2.3.4 Antibodies |
| 2.3.5 Coomassie blue staining |
| 2.3.6 Protein expression |
| 2.3.7 Protein purification |
| 2.4 Mouse immunization |
| 2.4.1 Mice |
| 2.4.2 Plasmid DNA immunization |
| 2.4.3 HCV pseudoparticles packaging and infection |
| 2.4.4 Preparation of cell-culture grown HCV replication |
| 2.4.5 Viral Titration |
| 2.4.6 Neutralization test |
| 2.4.7 Enzyme-linked immunosorbent assay |
| 2.4.8 Recognition of viral antigens by immune serum |
| Chapter3 Results |
| 3.1 Mammalian cells expression of HCV glycoprotein |
| 3.1.1 Construction of eukaryotic expression plasmids |
| 3.1.2 Generating stable cell lines that expressing hepatitis Cvirus glycoproteins |
| 3.1.3 Expression and purification of E2- BLd |
| 3.2 Prokaryotic cells expression of HCV glycoprotein |
| 3.2.1 Construction of prokaryotic expression plasmids |
| 3.2.2 Optimizing prokaryotic expression condition |
| 3.2.3 Preparation and purification of prokaryotic expressed proteins |
| 3.3 Preparation of hepatitis C virus |
| 3.3.1 Hepatitis C virus pseudo particles packaging |
| 3.3.2 Cell culture grown hepatitis C virus preparation |
| 3.4 In vivo expression approach using DNA mouse immunization |
| 3.4.1 Mice immunization strategies |
| 3.4.2 Neutralization ability of the immunized mice sera towards HCVcc |
| 3.4.3 Validate the specific antibodies in mice sera by ELISA |
| 3.4.4 Immunized mice sera recognize viral antigen |
| Chapter4 Discussion |
| Chapter5 Conclusion and prospect |
| References |
| Appendix |
| Acknowledgement |
| About the author |
（6）宿主蛋白SYNCRIP和MCM3在猪细小病毒复制过程中作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词及中英文对照 |
| 文献综述 |
| 第一章 宿主蛋白Syncrip和 MCM在病毒复制过程中作用及机制研究进展 |
| 1.1 Syncrip在宿主细胞m RNA可变剪接和病毒复制过程中作用及机制 |
| 1.1.1 Syncrip在宿主细胞m RNA可变剪接过程中作用及机制 |
| 1.1.2 可变剪接在病毒复制过程中作用及机制 |
| 1.1.3 Syncrip在病毒复制过程中作用及机制 |
| 1.2 MCM在宿主细胞DNA复制和病毒复制过程中作用及机制 |
| 1.2.1 MCM在宿主细胞DNA复制过程中作用及机制 |
| 1.2.2 MCM在病毒复制过程中作用及机制 |
| 第二章 细小病毒与宿主蛋白互作机制研究进展 |
| 2.1 细小病毒概述 |
| 2.2 细小病毒与宿主蛋白互作机制 |
| 2.2.1 细小病毒与宿主蛋白互作在病毒粘附和侵入过程中作用 |
| 2.2.2 细小病毒与宿主蛋白互作在病毒入核和复制过程中作用 |
| 2.2.3 细小病毒与宿主蛋白互作在病毒出核过程中作用 |
| 2.3 本研究的目的和意义 |
| 试验研究 |
| 第三章 猪细小病毒非结构蛋白NS多克隆抗体制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 ns基因的生物信息学分析 |
| 3.2.2 重组质粒p ET-32a-NS构建和鉴定 |
| 3.2.3 NS重组蛋白的诱导表达 |
| 3.2.4 NS重组蛋白的诱导表达条件优化 |
| 3.2.5 NS重组蛋白的纯化 |
| 3.2.6 NS蛋白多克隆抗体制备 |
| 3.2.7 NS蛋白多克隆抗体效价检测 |
| 3.2.8 NS蛋白多克隆抗体的特异性检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 ns基因的生物信息学分析 |
| 3.3.2 重组质粒p ET-32a-NS的构建和鉴定 |
| 3.3.3 NS重组蛋白的诱导表达检测 |
| 3.3.4 NS重组蛋白表达条件的优化 |
| 3.3.5 NS重组蛋白的纯化 |
| 3.3.6 鼠抗NS血清抗体的效价测定 |
| 3.3.7 多克隆抗体的特异性检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 稳定携带遗传标记的猪细小病毒全长感染性克隆构建及其生物学特性研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 PPV的增殖及病毒滴度检测 |
| 4.2.2 p KQLL(F1+F2)质粒的构建 |
| 4.2.3 PPV全长感染性克隆质粒的构建 |
| 4.2.4 病毒拯救及鉴定 |
| 4.2.5 拯救病毒的遗传稳定性检测 |
| 4.2.6 拯救病毒的复制特性检测 |
| 4.2.7 拯救病毒诱导凋亡特性检测 |
| 4.2.8 动物试验验证 |
| 4.2.9 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 PPV病毒滴度的测定 |
| 4.3.2 PPV全长感染性克隆质粒的构建和鉴定 |
| 4.3.3 拯救病毒的鉴定 |
| 4.3.4 拯救病毒的遗传稳定性鉴定 |
| 4.3.5 拯救病毒的复制特性 |
| 4.3.6 拯救病毒诱导凋亡特性的鉴定 |
| 4.3.7 动物试验 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 猪细小病毒NS1-m RNA关键宿主互作蛋白筛选及鉴定 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 NS1-m RNA的生物素化标记 |
| 5.2.2 NS1-m RNA关键宿主互作蛋白的筛选 |
| 5.2.3 syncrip基因的克隆、真核表达以及原核表达载体的构建 |
| 5.2.4 RNA-pulldown检测NS1-m RNA和 Syncrip的互作 |
| 5.2.5 RIP检测NS1-m RNA和 Syncrip的互作 |
| 5.2.6 荧光原位杂交(Fish)检测NS1-m RNA和 Syncrip的互作 |
| 5.2.7 EMSA检测NS1-m RN A和 Syncrip的互作 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 NS1-m RNA关键宿主互作蛋白的筛选 |
| 5.3.3 RNA-pulldown鉴定NS1-m RNA和 Syncrip的互作 |
| 5.3.4 RIP鉴定NS1-m RNA和 Syncrip的互作 |
| 5.3.5 荧光原位杂交(Fish)鉴定NS1-m RNA和 Syncrip的互作 |
| 5.3.6 EMSA鉴定NS1-m RN A和 Syncrip的互作 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 宿主蛋白Syncrip在猪细小病毒复制过程中作用及机制 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒 |
| 6.1.2 实验动物 |
| 6.1.3 主要试剂 |
| 6.1.4 主要仪器设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 干扰syncrip基因的表达对PPV复制的影响 |
| 6.2.2 syncrip基因敲除细胞系的构建 |
| 6.2.3 syncrip基因敲除对PPV复制的影响 |
| 6.2.4 syncrip基因敲除对NS2 表达的影响 |
| 6.2.5 PPV ns2 缺失型感染性克隆的构建及ns2 缺失对PPV复制的影响 |
| 6.2.6 PPV对 Syncrip表达的调控 |
| 6.2.7 检测Syncrip过表达对NS1 表达的影响 |
| 6.2.8 ns2剪接位点突变载体的构建 |
| 6.2.9 检测Syncrip调控NS1-m RNA表达的方式 |
| 6.2.10 数据分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 干扰syncrip基因的表达显着抑制PPV的复制 |
| 6.3.2 syncrip基因敲除细胞系的构建 |
| 6.3.3 syncrip基因敲除显着抑制PPV的复制 |
| 6.3.4 syncrip基因敲除显着抑制NS2 的表达 |
| 6.3.5 PPVns2缺失型感染性克隆的鉴定 |
| 6.3.6 PPV的复制水平与Syncrip的表达水平呈正相关 |
| 6.3.7 Syncrip能够促进NS1 的剪切 |
| 6.3.8 ns2剪接位点突变载体的鉴定 |
| 6.3.9 Syncrip通过作用于ns1上ns2的3’末端调控ns2 剪接 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 猪细小病毒VP2关键宿主互作蛋白筛选及鉴定 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒 |
| 7.1.2 主要试剂 |
| 7.1.3 主要仪器设备 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 vp2基因的克隆、原核表达载体及真核表达载体的构建 |
| 7.2.2 VP2关键宿主互作蛋白的筛选 |
| 7.2.3 mcm3基因的克隆、原核表达载体与真核表达载体的构建 |
| 7.2.4 免疫共沉淀(Co-IP)检测VP2和MCM3 的互作 |
| 7.2.5 间接免疫荧光检测VP2和MCM3的互作 |
| 7.2.6 GST-pulldown和 His-pulldown检测VP2和MCM3 的互作 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 VP2原核表达载体和真核表达载体的鉴定 |
| 7.3.2 VP2关键宿主互作蛋白的筛选 |
| 7.3.3 MCM3原核表达载体与真核表达载体的鉴定 |
| 7.3.4 Co-IP鉴定VP2和MCM3 互作 |
| 7.3.5 间接免疫荧光鉴定VP2和MCM3互作 |
| 7.3.6 GST-pulldown和 His-pulldown鉴定VP2和MCM3 的互作 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 第八章 VP2及其互作蛋白MCM3在猪细小病毒复制过程中作用及机制 |
| 8.1 材料 |
| 8.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒 |
| 8.1.2 主要试剂 |
| 8.1.3 主要仪器设备 |
| 8.2 方法 |
| 8.2.1 干扰vp2基因表达对PPV复制的影响 |
| 8.2.2 mcm3基因敲除细胞系的构建 |
| 8.2.3 mcm3 基因敲除对PPV复制的影响 |
| 8.2.4 VP2截短体原核表达载体的构建 |
| 8.2.5 VP2和MCM3互作结构域的检测 |
| 8.2.6 NS1真核表达载体的构建 |
| 8.2.7 检测VP2/NS1/MCM3和PPV DNA互作 |
| 8.2.8 DNA-pulldown检测VP2、NS1、MCM3和PPV DNA的互作 |
| 8.2.9 NS1与MCM3互作的检测 |
| 8.2.10 VP2 与病毒DNA及 MCM3 之间互作的检测 |
| 8.2.11 VP2与PPV基因组DNA结合基序的检测 |
| 8.2.12 VP2结合基序突变型PPV的构建及对病毒复制的影响 |
| 8.2.13 数据分析 |
| 8.3 结果 |
| 8.3.1 干扰vp2基因表达显着抑制PPV的复制 |
| 8.3.2 mcm3 基因敲除显着抑制PPV的复制 |
| 8.3.3 VP2截短体原核表达载体的鉴定 |
| 8.3.4 VP2的115 aa~231 aa是其与宿主蛋白MCM3 发生互作的关键结构域 |
| 8.3.5 NS1真核表达载体的鉴定 |
| 8.3.6 在PPV复制过程中VP2/NS1/MCM3 与病毒DNA存在互作 |
| 8.3.7 VP2和NS1在PPV复制过程中与病毒DNA存在直接互作 |
| 8.3.8 NS1 不参与招募MCM3 到病毒基因组DNA |
| 8.3.9 VP2 负责招募MCM3 到病毒基因组DNA |
| 8.3.10 VP2 结合于PPV基因组DNA的300 nt~356 nt基序 |
| 8.3.11 突变PPV基因组DN A的 VP2 结合基序完全阻止病毒DNA的复制. |
| 8.4 讨论 |
| 8.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）增强染料脱色过氧化物酶TfuDyP在重组大肠杆菌中的催化活性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 染料脱色过氧化物酶的概述 |
| 1.1.1 染料脱色过氧化物酶的来源 |
| 1.1.2 染料脱色过氧化物酶的特征 |
| 1.1.3 染料脱色过氧化物酶的生物潜能 |
| 1.2 血红素的简介 |
| 1.2.1 血红素的生物特性 |
| 1.2.2 血红素的生物合成途径 |
| 1.2.3 血红素与染料脱色过氧化物酶的关系 |
| 1.3 染料脱色过氧化物酶对染料的降解 |
| 1.3.1 染料废水的简介 |
| 1.3.2 染料脱色方法 |
| 1.4 大肠杆菌中蛋白胞外分泌 |
| 1.4.1 大肠杆菌蛋白分泌方法简介 |
| 1.4.2 OsmY的简介 |
| 1.5 立题依据与主要研究内容 |
| 1.5.1 立题依据与研究意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒与菌株 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 培养基与溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组质粒的构建 |
| 2.2.2 重组菌蛋白的诱导表达与鉴定 |
| 2.2.3 外源添加物含量的优化 |
| 2.3 检测方法 |
| 2.3.1 胞内血红素浓度的测定 |
| 2.3.2 卟啉类物质定性的测定 |
| 2.3.3 蛋白溶液浓度测定 |
| 2.3.4 TfuDyP的光谱分析 |
| 2.3.5 TfuDyP的活性检测 |
| 2.3.6 TfuDyP对染料的脱色测定 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 过表达大肠杆菌中血红素合成途径关键酶基因对血红素含量的影响 |
| 3.1.1 大肠杆菌血红素代谢合成途径基因表达菌株的构建 |
| 3.1.2 重组菌株的诱导表达与SDS-PAGE电泳检测 |
| 3.1.3 过表达关键酶基因对大肠杆菌血红素合成的影响 |
| 3.1.4 小结 |
| 3.2 hem A和 TfuDyP在大肠杆菌中的共表达对TfuDyP活性的影响 |
| 3.2.1 hem A与 TfuDyP共表达菌株的构建 |
| 3.2.2 重组蛋白的表达与纯化鉴定 |
| 3.2.3 对重组菌外源添加FeCl2、谷氨酸的优化 |
| 3.2.4 重组菌卟啉含量的定性检测和胞内血红素浓度测定 |
| 3.2.5 TfuDyP的光谱吸收 |
| 3.2.6 TfuDyP的比酶活检测 |
| 3.2.7 小结 |
| 3.3 TfuDyP在染料脱色中的应用 |
| 3.3.1 TfuDyP粗酶的获取 |
| 3.3.2 TfuDyP粗酶对双偶氮类、蒽醌类、三苯甲烷类染料的脱色 |
| 3.3.3 TfuDyP处理三苯甲烷类染料溴甲酚绿脱色条件的优化 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 利用Osm Y蛋白介导大肠杆菌外源蛋白TfuDyP的胞外分泌 |
| 3.4.1 Osm Y与 TfuDyP基因融合表达载体的构建 |
| 3.4.2 融合蛋白的诱导表达与SDS-PAGE电泳检测 |
| 3.4.3 胞外培养液TfuDyP酶活性检测 |
| 3.4.4 小结 |
| 主要结论及展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（8）ZIKA病毒关键免疫原蛋白的制备及DNA疫苗的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 |
| 1.1 ZIKA病毒研究概况 |
| 1.1.1 ZIKA病毒的历史和流行病学 |
| 1.1.2 ZIKA病毒的传播方式 |
| 1.1.3 ZIKA病毒的临床症状 |
| 1.1.4 ZIKA病毒的分子生物学 |
| 1.2 ZIKA病毒疫苗研究概况 |
| 1.2.1 纯化灭活疫苗 |
| 1.2.2 减毒活疫苗 |
| 1.2.3 嵌合病毒疫苗 |
| 1.2.4 纯化的病毒样颗粒 |
| 1.2.5 亚单位疫苗 |
| 1.2.6 基因疫苗 |
| 1.3 基因疫苗概述 |
| 1.3.1 基因疫苗作用机制 |
| 1.3.2 基因疫苗的优势 |
| 1.3.3 基因疫苗免疫途径和方法 |
| 1.4 本论文研究的意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 ZIKA病毒E蛋白的原核表达与纯化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 质粒与菌株 |
| 2.2.2 主要的酶和生化试剂 |
| 2.2.3 核酸 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 ZIKA病毒E80 基因片段的PCR扩增 |
| 2.4.2 原核重组质粒pET-28a-ZIKA-E80 的构建 |
| 2.4.3 最佳诱导条件的确立 |
| 2.4.4 ZIKA病毒E80 基因原核诱导表达 |
| 2.4.5 ZIKA病毒E80 基因原核表达蛋白的纯化 |
| 2.4.6 Western-Blot免疫印迹分析 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 pET-28a-ZIKA-E80 基因片段的扩增 |
| 2.5.2 原核重组质粒pET-28a-ZIKA-E80 双酶切鉴定 |
| 2.5.3 最佳诱导条件的确立 |
| 2.5.4 重组蛋白表达形式的鉴定 |
| 2.5.5 ZIKA病毒E80 基因原核表达蛋白的纯化分析 |
| 2.5.6 重组质粒pET-28a-ZIKA-E80 表达产物的Western Blot分析 |
| 2.6 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 ZIKA病毒M蛋白的原核表达与纯化 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 质粒与菌株 |
| 3.2.2 主要的酶和生化试剂 |
| 3.2.3 核酸 |
| 3.3 实验仪器 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 ZIKA病毒M基因片段的PCR扩增 |
| 3.4.2 原核重组质粒pET-28a-ZIKA-M的构建 |
| 3.4.3 ZIKA病毒M基因原核诱导表达 |
| 3.4.4 原核重组质粒pET-28a-ZIKA-M90 的构建 |
| 3.4.5 ZIKA病毒M90 基因原核诱导表达 |
| 3.4.6 ZIKA病毒M90 基因原核表达蛋白的纯化 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 ZIKA病毒M基因片段的PCR扩增 |
| 3.5.2 原核重组质粒pET-28a-ZIKA-M的双酶切鉴定 |
| 3.5.3 ZIKA病毒M基因原核诱导表达 |
| 3.5.4 原核重组质粒pET-28a-ZIKA-M90 的构建 |
| 3.5.5 ZIKA病毒M90 基因原核诱导表达 |
| 3.5.6 ZIKA病毒M90 基因原核表达蛋白的纯化 |
| 3.6 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 ZIKA病毒DNA疫苗初步研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要生化试剂 |
| 4.2.2 实验动物 |
| 4.2.3 核酸 |
| 4.3 实验仪器 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 构建重组质粒pCMV-S-ZIKA-ME |
| 4.4.2 碱裂解法大量提取重组质粒pCMV-S-ZIKA-ME |
| 4.4.3 重组质粒体内转染小鼠 |
| 4.4.4 Western-Blot检测蛋白的表达 |
| 4.4.5 PEI-DNA复合物的制备 |
| 4.4.6 重组质粒雾化免疫小鼠 |
| 4.4.7 Western-Blot定性检测血清抗性 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 重组质粒pCMV-S-ZIKA-ME的双酶切鉴定 |
| 4.5.2 重组质粒浓度及纯度测定 |
| 4.5.3 Western-Blot检测融合蛋白 |
| 4.5.4 Western-Blot定性检测血清抗性 |
| 4.6 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（9）靶向对虾白斑综合征病毒纳米给药系统研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 白斑病及白斑综合征病毒 |
| 1.1.1 WSD的症状和病理变化 |
| 1.1.2 WSSV的形态结构 |
| 1.1.3 WSSV的基因组结构 |
| 1.1.4 WSSV的病毒蛋白及其功能 |
| 1.1.5 WSD的防控 |
| 1.2 抗病毒药物概述 |
| 1.2.1 抗病毒药物的分类 |
| 1.2.2 抗病毒药物的作用机制 |
| 1.2.3 中草药在抗病毒药物开发中的应用 |
| 1.3 栀子及其活性成分的研究 |
| 1.3.1 栀子的化学成分研究 |
| 1.3.2 栀子及其活性成分的药理学研究 |
| 1.4 碳纳米管载药系统研究 |
| 1.4.1 CNTs作为小分子化合物呈递载体的研究 |
| 1.4.2 CNTs作为基因蛋白类药物呈递载体的研究 |
| 1.5 选题目的和意义 |
| 第二章 中草药抗WSSV活性筛选 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 动物与病毒 |
| 2.1.2 药物 |
| 2.1.3 试剂和仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 标准质粒p MD19T-VP28141 的构建 |
| 2.2.2 绝对荧光定量PCR标准曲线的构建 |
| 2.2.3 健康的克氏原螯虾挑选 |
| 2.2.4 WSSV攻毒浓度检测 |
| 2.2.5 克氏原螯虾体内WSSV的时空动态分析 |
| 2.2.6 中草药粗提物制备 |
| 2.2.7 中草药粗提物对克氏原螯虾的急性毒性 |
| 2.2.8 中草药粗提物在克氏原螯虾体内抗WSSV活性检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绝对定量WSSV基因组DNA拷贝数方法的建立 |
| 2.3.2 WSSV致病性分析 |
| 2.3.3 克氏原螯虾不同组织中WSSV基因组DNA拷贝数的动态变化 |
| 2.3.4 克氏原螯虾鳃组织中WSSV基因表达水平的动态变化 |
| 2.3.5 中草药粗提物对克氏原螯虾的急性毒性 |
| 2.3.6 中草药粗提物在克氏原螯虾体内抗WSSV活性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 栀子粗提物抗WSSV活性研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 动物与病毒 |
| 3.1.2 药物 |
| 3.1.3 试剂和仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 栀子粗提物在克氏原螯虾体内抗WSSV活性检测 |
| 3.2.2 栀子粗提物主要活性成分含量检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 栀子粗提物在克氏原螯虾体内抗WSSV活性 |
| 3.3.2 栀子粗提物主要活性成分含量检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 栀子3种活性成分抗WSSV活性研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 动物与病毒 |
| 4.1.2 药物 |
| 4.1.3 试剂和仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 GP、GPA和 GN对克氏原螯虾的安全性评价 |
| 4.2.2 GP、GPA和 GN在克氏原螯虾体内抗WSSV活性检测 |
| 4.2.3 GP、GPA和 GN在南美白对虾体内抗WSSV活性检测 |
| 4.2.4 GP和GPA的药代动力学研究 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 GP、GPA和 GN对克氏原螯虾的安全性评价 |
| 4.3.2 GP、GPA和 GN在克氏原螯虾体内抑制WSSV复制 |
| 4.3.3 GP、GPA和 GN提高感染WSSV克氏原螯虾的存活率 |
| 4.3.4 GP、GPA和 GN调控克氏原螯虾基因的表达 |
| 4.3.5 GP、GPA和 GN在南美白对虾体内抗WSSV活性 |
| 4.3.6 GP和GPA在克氏原螯虾体内的药代动力学研究 |
| 4.3.7 GP和GPA在南美白对虾体内的药代动力学研究 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 GP、GPA和 GN对 WSSV蛋白功能的作用研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 动物、细胞和病毒 |
| 5.1.2 药物 |
| 5.1.3 试剂和仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 GP、GPA和 GN对 WSSV增殖的影响 |
| 5.2.2 p AC5.1-EGFP表达载体的构建及鉴定 |
| 5.2.3 WSSV囊膜蛋白真核表达载体的构建 |
| 5.2.4 GP、GPA和 GN对 WSSV囊膜蛋白在果蝇S2 细胞表达的影响 |
| 5.2.5 GP、GPA和 GN对 STAT基因转录的影响 |
| 5.2.6 GP、GPA和 GN与 WSSV囊膜蛋白分子对接模型预测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 GP、GPA和 GN对 WSSV增殖的影响 |
| 5.3.2 WSSV囊膜蛋白真核表达载体的构建和鉴定 |
| 5.3.3 GP、GPA和 GN对 WSSV囊膜蛋白细胞内表达的影响 |
| 5.3.4 GP、GPA和 GN对 STAT基因转录的作用结果 |
| 5.3.5 GP、GPA和 GN与 WSSV囊膜蛋白的分子对接结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 靶向WSSV纳米给药系统构建及效果评价 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 细胞、动物与病毒 |
| 6.1.2 药物 |
| 6.1.3 仪器 |
| 6.1.4 试剂 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 p ET32a-P75E8 原核表达载体的构建 |
| 6.2.2 P75E8重组蛋白的表达与纯化 |
| 6.2.3 P75E8重组蛋白活性鉴定 |
| 6.2.4 p AC5.1-m Cherry真核表达载体的构建 |
| 6.2.5 p AC5.1-P75E8-m Cherry真核表达载体的构建 |
| 6.2.6 P75E8与VP28在果蝇S2细胞内的作用 |
| 6.2.7 P75E8与VP28互作位点研究 |
| 6.2.8 纳米给药系统的构建 |
| 6.2.9 纳米给药系统的表征 |
| 6.2.10 纳米给药系统在克氏原螯虾体内抗WSSV活性 |
| 6.2.11 纳米给药系统在克氏原螯虾体内的药代动力学 |
| 6.2.12 纳米给药系统在南美白对虾仔虾体内抗WSSV活性 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 单链抗体P75E8原核表达载体的构建和表达 |
| 6.3.2 P75E8重组蛋白活性鉴定 |
| 6.3.3 P75E8与VP28的相互作用 |
| 6.3.4 P75E8与VP28互作位点研究 |
| 6.3.5 纳米给药系统构建及表征 |
| 6.3.6 纳米给药系统在克氏原螯虾体内抑制WSSV复制 |
| 6.3.7 纳米给药系统提高感染WSSV克氏原螯虾的存活率 |
| 6.3.8 纳米给药系统在克氏原螯虾鳃组织中的代谢分析 |
| 6.3.9 纳米给药系统在南美白对虾仔虾体内抗WSSV活性 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）鸭坦布苏病毒核酸斑点杂交方法的建立及E蛋白的原核表达（论文提纲范文）
| 符号说明 中文摘要 英文摘要 1 前言 |
| 1.1 病原 |
| 1.1.1 病名定义与历史概述 |
| 1.1.2 坦布苏病毒的病原特点 |
| 1.1.3 坦布苏病毒的宿主 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 鸭坦布苏病临床特征 |
| 1.3.1 临床病理变化 |
| 1.3.2 开产种(蛋)禽 |
| 1.3.3 后备种(蛋)禽 |
| 1.3.4 雄性家禽 |
| 1.4 病理组织学变化 |
| 1.5 鸭坦布苏病的检测和诊断 |
| 1.5.1 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.5.2 乳胶凝集试验(LAT) |
| 1.5.3 RT-PCR技术 |
| 1.5.4 实时荧光定量RT-PCR技术 |
| 1.5.5 环介导等温扩增(RT-LAMP)技术 |
| 1.5.6 核酸探针技术 |
| 1.6 鸭坦布苏病毒的潜在威胁 |
| 1.7 防治措施 |
| 1.8 展望 |
| 1.9 本研究的目的和意义 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料及毒株来源 |
| 2.1.2 主要仪器和试剂 |
| 2.1.3 试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 DTMUV斑点杂交方法的建立 |
| 2.2.2 一株TMUV野毒的分离鉴定与全基因组序列分析 |
| 2.2.3 鸭坦布苏病毒全基因序列的分析 |
| 2.2.4 鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达 3 结果 |
| 3.1 核酸斑点杂交方法的建立与应用 |
| 3.1.1 TMUVNS5基因的扩增 |
| 3.1.2 探针的制备 |
| 3.1.3 核酸斑点杂交方法灵敏度检测 |
| 3.1.4 核酸斑点杂交方法特异性检测 |
| 3.1.5 核酸斑点杂交方法的应用 |
| 3.2 一株鸭坦布苏病毒的分离鉴定和全基因组序列分析 |
| 3.2.1 一株鸭坦布苏病毒的分离鉴定 |
| 3.2.2 TMUVSD1601株全基因组序列的分析 |
| 3.3 E蛋白的原核表达 |
| 3.3.1 E基因的扩增结果 |
| 3.3.2 重组质粒pGEX-E的酶切鉴定 |
| 3.3.3 GST-E融合蛋白的诱导表达 |
| 3.3.4 重组E蛋白最佳表达条件的探索 |
| 3.3.5 重组E蛋白的Westernblot鉴定 |
| 3.3.6 GST-E融合蛋白纯化 4 讨论 5 结论 参考文献 致谢 硕士期间发表的论文 |
四、超声处理对大肠杆菌HCV-NS_3融合蛋白纯化的影响（论文参考文献）
- [1]猪GRP多克隆抗体的制备与应用及其对Leydig cells睾酮分泌的影响[D]. 郭军培. 扬州大学, 2021
- [2]蜂王浆主蛋白2抑制幼虫芽孢杆菌的机理分析及体外重组表达[D]. 段香媛. 中国农业科学院, 2021
- [3]裂解酶P26ly对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌生物被膜清除作用的研究[D]. 张瑶. 昆明理工大学, 2021(02)
- [4]猪源抗猪腹泻重要病原体单链抗体及其保护作用研究[D]. 张凡庆. 上海交通大学, 2020(01)
- [5]针对丙型肝炎病毒E2包膜糖蛋白后层结构域开发相应中和抗体[D]. 王珵珵. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2020(08)
- [6]宿主蛋白SYNCRIP和MCM3在猪细小病毒复制过程中作用及机制研究[D]. 陈松彪. 西北农林科技大学, 2020
- [7]增强染料脱色过氧化物酶TfuDyP在重组大肠杆菌中的催化活性[D]. 顾鹏帅. 江南大学, 2020(01)
- [8]ZIKA病毒关键免疫原蛋白的制备及DNA疫苗的初步研究[D]. 白琴琴. 山西大学, 2020(01)
- [9]靶向对虾白斑综合征病毒纳米给药系统研究[D]. 黄爱国. 西北农林科技大学, 2020(02)
- [10]鸭坦布苏病毒核酸斑点杂交方法的建立及E蛋白的原核表达[D]. 王瑞明. 山东农业大学, 2018(09)