一、嗅神经鞘细胞移植修复成鼠半横断胸髓损伤（论文文献综述）
陈春茂[1]（2019）在《仿生静电纺水凝胶纤维束支架用于脊髓损伤修复的研究》文中研究表明第一部分 GelMA水凝胶生物支架的制作及其材料结构和性能表征[目的]构建定向Gelatin和GelMA水凝胶生物支架,并评估相关物理和化学性能。[方法]首先制备GelMA材料,再使用静电纺丝和紫外光照交联,制备出定向GelMA水凝胶纤维,通过纤维的多次折叠即可得到纤维束。使用静电纺丝技术制备出定向Gelatin和GelMA纤维,再通过戊二醛的交联作用,得到定向Gelatin水凝胶纤维,通过光交联获得GelMA水凝胶纤维,再通过纤维的多次折叠得到相应的纤维束支架。采用SEM对材料进行拍照,所得的图像结合NanoMesurer软件分析两组纤维的直径分布情况,采用吸水称重的方式评估支架的吸水率,将纤维支架放置在PBS中,通过称重,考察纤维支架的降解率。通过生物力学仪器测试其力学性能。[结果]经过SEM图片和NanoMesurer分析,本实验通过平行接收装置制备出表面光滑,具有相同方向的纤维支架,而滚筒接收制备的纤维支架是定向性较差。其中GelMA纤维支架的直径为1.1±0.13um,Gelatin纤维支架的直径为1.4±0.13um;通过力学测试,可以得到两种纤维支架都具有一定的弹性。其中GelMA纤维支架的最大拉伸长度是原长度的4.54倍,Gelatin纤维支架的最大拉伸长度近原长度的1.94倍。通过计算杨氏模量可以得到,GelMA纤维支架的杨氏模量为0.7Kpa,远远小于Gelatin纤维支架的杨氏模量（1.5Kpa）。而循环应力-应变结果结果显示,Gelatin纤维支架的应力应变曲线的斜率,随着反复拉伸有很大的变化。于此相反,GelMA纤维支架的曲线斜率基本不变。吸水率的测试结果显示,在0天时,GelMA纤维支架的吸水率是本身的6.17倍,而Gelatin纤维支架为5.26倍。虽然随着时间的延长,两种支架的吸水率都在下降,但是GelMA支架的吸水率始终大于Gelatin（p<0.05）。降解实验显示,在第 3 天时,GelMA 剩余 94.8±0.84%,Gelatin 剩余 95.2±0.84（p>0.05）,但是随着时间的延长,Gelatin支架和GelMA支架的降解率差距在增大,35天后Gelatin支架剩余 40±1.58%,而 GelMA 支架只剩下 19±1.58%（p<0.05）。[结论]GelMA纤维支架具备定向良好的定向效果和力学性能,并且实现较好的保水性和可降解性。第二部分 GelMA水凝胶生物支架促进BMSCs和神经元细胞的粘附和体外迁移的研究[目的]探讨定向Gelatin和GelMA水凝胶生物支架促进大鼠BMSCs和海马神经元细胞迁移、黏附、增殖的能力。[方法]将BMSCs种植在Gelatin和GelMA支架上,培养1天后,将种植在支架上的细胞进行酒精脱水,冻干后利用扫描电子显微镜观察细胞的粘附和迁移。将BMSCs种植在两种支架上后在第1和3天,使用CCK-8法检测细胞增殖率。通过鬼笔环肽染色检测支架促进细胞粘附的能力。使用活死细胞染色技术,检测支架的生物相容性。通过荧光染色,观察纤维支架对海马神经元细胞的形态和轴突生长的影响。采用共聚焦显微镜和鬼笔环肽染色,在培养细胞的1、2、3天后,进行拍照,考察Gelatin和GelMA支架促进细胞迁徙渗透的能力。[结果]BMSCs在Gelatin和GelMA支架上状态正常,粘附良好,且细胞朝GelMA支架深处迁移。鬼笔环肽染色显示,BMSCs在两种支架上都有很好的粘附,但对照组上细胞形状为不规则形状,朝向不定,而长在Gelatin和GelMA支架上的细胞细长,且定向。活死细胞染色结果显示,接种在Gelatin和GelMA的细胞大部分都存活。CCK-8结果显示,在培养的1、3天细胞正常增殖。GelMA支架显着促进细胞的增殖,相对于其余二组差异有显着统计学意义（p<0.01）,对海马神经元细胞的轴突染色结果显示,对照组上的海马神经元细胞没有生长,轴突没有延伸,非定向的两种纤维支架虽然可以促进轴突的延长,但是不能使轴突朝一个方向延伸。而Gelatin支架和GelMA支架上的海马神经元细胞不仅数量多,定向,而且轴突延伸性好,其中GelMA支架上的轴突延伸性最好。通过鬼笔环肽染色和共聚焦显微镜拍照,可以看出,GelMA支架上的细胞随着时间的延长,正在逐渐的往下迁移（第一天为38.9±4.92um,第二天为127.55±14.54um,第三天为197.5±18.lum）,而Gelatin支架上的细胞只有轻微迁移（第一天 24±4.35um,第二天 41.87±6.28um,第三天 60.6±8.4um）。定量数据显示GelMA组与Gelatin组相比,差异有统计学意义（p<0.05）。[结论]GelMA支架生物相容性良好,能促进细胞在支架上黏附、增殖、迁移;在体外有促进神经元轴突伸长的能力。第三部分 GelMA水凝胶生物支架促进脊髓损伤修复的研究[目的]探讨GelMA支架促进活体脊髓损伤修复的可行性。[方法]建立大鼠脊髓损伤模型,分为Gelatin和GelMA纤维支架和对照组。通过BBB运动评价量进行大鼠术后下肢运动功能的评价。在术后12周取脊髓进行组织切片及免疫组化染色(包括神经干细胞染色,神经元染色,神经轴突染色,胶质疤痕染色,星形胶质细胞染色,血管内皮细胞染色。观察神经修复、血管形成情况。[结果]通过评价下肢功能恢复情况可以判断支架修复脊髓的效果。术后第1、2、3、4、6、8、10、12周使用BBB量表进行大鼠后肢运动功能评价。结果显示,术后对照组和Gelatin组大鼠下肢自主运动功能恢复较慢且有限,GelMA组大鼠恢复较好。随着治疗时间的延长,GelMA组的治疗效果与另外两组相比,越来越好,当达到12周时GelMA组评分达到12.4±1.67,相对于空白组6.6±1.52和Gelatin组8±1.23有显着性差异（p<0.05）。本研究中脊髓神经再生观测指标包括神经干细胞、神经元以及神经突触。Nestin染色结果显示在损伤后12周仍能在损伤部位观察到神经干细胞的存在,通过光密度定量测定发现GelMA组脊髓中神经干细胞明显多于Gelatin组和空白对照组（p<0.05）,证明GelMA支架更适宜周围NSCs向支架内迁移并生存。而神经元是脊髓功能恢复的细胞基础,同样,Tuj-1标记的由NSCs分化的神经元在GelMA支架内于其Gelatin支架和对照组相比显着性增高（p<0.05）。神经突触免疫组化的定性和定量结果显示,GelMA支架组的synaptophysin阳性信号明显高于Gelatin组和空白对照组（p<0.05）,证明GelMA支架内有更多的突轴形成。星形胶质细胞和胶质疤痕的染色结果显示,Gelatin组和空白对照组有大量的胶质细胞增生和胶质疤痕形成,而GelMA组明显少（p<0.05）。通过对比12周后CD31标记的血管内皮细胞的图片,GelMA组比另外两组有着更多的荧光,定量结果显示差异有统计学意义（p<0.05）。[结论]用电纺水凝胶纤维构建的软仿生支架,不仅促进了神经干细胞的迁移,诱导其分化为神经元,而且抑制了其向胶质细胞分化,减少胶质瘢痕的形成,同时促进了血管生成。此外,该支架具有较高的弹性,可以在缺少骨性椎管保护的情况下抵抗变形。仿生的水凝胶微纤维在促进活体脊髓功能再生方面被证明是有效的。
周权明[2]（2016）在《NSCs与PLGA复合体移植对大鼠脊髓半横断损伤的修复作用》文中研究表明背景:目前脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）的预防、治疗和康复是目前临床工作种难以攻克的难题。而生物细胞学技术和组织工程技术的发展为治疗脊髓损伤带来新的治疗方案。目的:研究乳鼠脑组织源神经干细胞（neural stem cells,NSCs）,联合聚乳酸-乙醇酸工程支架（Poly-Lactic-co-glycolicacid,PLGA）移植治疗SD大鼠脊髓半横断损伤的效果。方法:（1）乳鼠NSCs的分离和培养的优化:取出生3天的SD乳鼠大脑颞叶皮质,分别用机械吹打法、胰蛋白酶消化法分离培养,通过免疫荧光法对NSCs进行鉴定和诱导分化;分别于培养的第2、5、7天计数细胞球直径及数目;通过MTT法比较原代及传代后第3亚代NSCs克隆增值速率。（2）NSC与PLGA复合体移植治疗SD大鼠脊髓半横断损伤修复作用:将72只雌性SD大鼠分成6组:正常组、假手术组、手术组、NSCs移植组、PLGA移植组、NSCs+PLGA复合体共移植组。制作脊髓半横断模型,正常组不做处理,假手术组仅摘除椎板;其他各组行脊髓右侧半横断术;术后第7天,再次打开脊髓,手术组于损伤处移入20ul培养液,NSCs移植组移入含NSCs培养液;PLGA移植组将PLGA组织工程支架植入脊髓损伤处;NSCs+PLGA复合体共移植组将NSCs+PLGA复合体植入脊髓损伤处。每组大鼠于术前1d、术后7d、移植后第1、2、4、8周行BBB评分、IP评分等行为学,于移植后第2、4、8周,行电生理MEPs检查、病理HE染色。结果:（1）NSCs的分离和培养的优化:机械吹打组与胰酶消化组获得的NSCs,行免疫荧光发现,Nestin、NF-200、GFAP染色均阳性,培养第5、7天时,机械吹打组获得的细胞球数量和直径均高于相同培养时间点的胰酶消化组,差异有统计学意义（p<0.05）。机械吹打组原代和第3亚代细胞第2、5天细胞克隆增殖能力均优于同时间节点的胰酶消化组,差异有统计学意义（p<0.05）。（2）行为学评价:移植后第4、8周时NSCs移植组、PLGA移植组、NSCs+PLGA复合体移植组BBB评分、IP评分高于手术组,差异有统计学意义（p<0.05）;NSCs移植组、PLGA移植两组比较,差异无统计学意义（p>0.05）。移植后第4、8周,NSCs+PLGA复合体移植组BBB评分、IP评分高于NSCs移植组、PLGA移植组,差异具有统计学意义（p<0.05）。（3）电生理:运动诱发电位（MEPs）潜伏期比较显示:移植后第2、4、8周,NSCs移植组、PLGA移植组、NSCs+PLGA复合体移植组优于手术组（p<0.05）;移植后第2、4、8周NSCs+PLGA复合体移植组优于NSCs移植组、PLGA移植组（p<0.05）。同时间点各组健侧MEPs的潜伏期轻度优于手术侧,但是在统计学上差异无意义（p>0.05）。（4）病理HE染色:各实验组脊髓组织行HE染色后,发现移植后第8周时,NSCs移植组、PLGA移植组、NSCs+PLGA移植组损伤处脊髓组织结构较前有所恢复,空洞、瘢痕组织少于手术组。NSCs+PLGA复合体移植组周围组织结构恢复更好,空洞、瘢痕组织少于NSCs移植组、PLGA移植组。结论:1.机械吹打法、胰酶消化法均可成功分离培养、诱导分化NSCs,但是机械吹打法分离培养的NSCs的克隆增殖能力优于胰酶消化法。2.通过行为学、电生理及病理学评估发现NSCs+PLGA复合体移植对SD大鼠脊髓半横断损伤有一定的修复作用,尤其对后肢运动能力的恢复比较明显。但是对脊髓损伤的解剖结构的重塑和功能的恢复作用有限。3.NSCs、PLGA单独移植时行为学、电生理、病理学评价较手术组有一定的改善,但改善程度弱于两者复合体移植治疗。
鞠前前[3]（2016）在《牛膝多肽对单侧坐骨神经横断诱导的脊髓和背根神经节细胞凋亡的影响》文中研究表明第一部分:建立脊髓细胞凋亡的动物模型目的:选择性横断单侧坐骨神经,构建脊髓细胞凋亡的动物模型。方法:在右侧坐骨神经分叉上方切断新生大鼠的坐骨神经,用浸有无菌生理盐水（NS）的无菌止血海绵包裹坐骨神经近侧断端,建立脊髓细胞凋亡的动物模型。运用TUNEL免疫荧光、Quantitative Real-time PCR和Western blot技术对不同时间点的模型进行形态学观察。结果:1.TUNEL免疫荧光染色结果显示,坐骨神经横断6h、12h、24h、48h后脊髓细胞的凋亡数量与模型组相比差异具有统计学意义（P<0.05）,且损伤24h后TUNEL阳性细胞的数量最多。2.Quantitative Real-time PCR检测结果显示,坐骨神经损伤后Caspase-3的转录水平随着时间的延长逐渐增高,且在24h达到高峰;Bax与Bcl-2的转录水平也随着损伤时间的延长而增高,Bax在12h达高峰,而Bcl-2在这个过程中只是略微增高,并于24h的转录水平呈现高峰期,其中Bcl-2/Bax的比值在12h和24h时最小。坐骨神经横断后的6h、12h、24h及48h,促凋亡基因Caspase-3与bax的表达明显增多,与假手术组相比差异有统计学意义（P<0.05）。3.Western blot结果同Quantitative Real-time PCR检测结果相同,损伤后不同时间点（6h、12h、24h、48h）Caspase-3、Bax的表达明显增高,而Bcl-2的表达只是略有增加。提示细胞凋亡模型制备成功。结论:成功建立脊髓细胞凋亡模型。第二部分:牛膝多肽对单侧坐骨神经横断后脊髓和背根神经节细胞凋亡的影响目的:检测牛膝多肽对单侧坐骨神经横断诱导的脊髓和背根神经节细胞凋亡的影响,探讨牛膝多肽在脊髓和背根神经节细胞凋亡中的作用及机制,为临床脊髓损伤的治疗提供理论基础和实验依据。方法:1.本实验以出生1d的SD大鼠为研究对象,坐骨神经横断后在近侧断端分别给予生理盐水（NS）、神经生长因子-β（NGF-β）及不同浓度的牛膝多肽（0.001mg/ml、0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml）,从而将实验对象分为假手术组、阴性对照组、阳性对照组及实验组。2.TUNEL免疫荧光技术检测腰膨大处脊髓和背根神经节细胞的凋亡情况。3.Quantitative Real-time PCR检测Caspase-3、Bcl-2、Bax的m RNA转录水平变化。4.Western blot检测Caspase-3、Bcl-2、Bax的蛋白表达水平变化。结果:1.TUNEL免疫荧光结果显示,应用牛膝多肽（0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml）后脊髓和背根神经节细胞凋亡的数量比NS组阳性数都有减少,具有统计学意义（P<0.05）。2.Quantitative Real-time PCR检测结果表明,坐骨神经横断后给予不同浓度的牛膝多肽,Caspase-3、Bax的表达水平均有不同程度的下降,其中牛膝多肽0.1mg/ml、1mg/ml组Caspase-3、Bax的m RNA表达水平明显低于NS组,差异具有统计学意义（P<0.05）,与假手术组和NGF-β组比较无统计学意义（P>0.05）。抗凋亡基因Bcl-2的表达升高,且在给予0.1mg/ml、1mg/ml的牛膝多肽时升高更显着,Bcl-2/Bax的比值变化亦是如此。3.Western blot实验结果显示,给予牛膝多肽后促凋亡蛋白Caspase-3、Bax的表达减少而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达增加,当牛膝多肽浓度为0.1mg/ml、1mg/ml时,三个凋亡相关因子的表达在实验组与阳性对照组比较均无统计学意义（P>0.05）,且分析结果表明,当牛膝多肽浓度为0.1mg/ml、1mg/ml时,Bcl-2/Bax的比值最高。结论:牛膝多肽能抑制单侧坐骨神经横断诱导的脊髓和背根神经节细胞凋亡,具有神经保护作用。这种保护作用主要是通过抑制促凋亡基因Caspase-3和Bax的表达的同时促进抗凋亡基因Bcl-2的表达,从而减少由单侧坐骨神经横断诱导的脊髓和背根神经节细胞的凋亡实现的。
黄镇[4]（2012）在《神经干细胞和嗅粘膜嗅鞘细胞共培养及移植治疗切割海马伞大鼠的研究》文中指出目的：比较大鼠嗅粘膜（Olfactory Mucosa，OM）和嗅球（Olfactory Bulb，OB）嗅鞘细胞（Olfactory ensheathing cells，OECs）在体外分离培养中增殖和分化以及生物学特性的差异；研究嗅粘膜OECs和神经干细胞（Neural stem cells, NSCs）直接接触和非直接接触共培养对NSCs增殖和分化的影响；将嗅粘膜OECs和NSCs移植到切割海马伞大鼠脑中，观察大鼠行为改善以及NSCs的存活和分化情况。为应用嗅鞘细胞和神经干细胞治疗神经系统疾病奠定理论基础。方法：（1）分别取SD大鼠嗅粘膜（OM）和嗅球（OB）用差速贴壁法在体外分离培养嗅鞘细胞（OECs），在倒置显微镜下观察并拍摄嗅鞘细胞的生长情况；（2）用扫描电镜观察嗅粘膜及嗅球OECs的形态；（3）用Elisa法检测嗅粘膜及嗅球OECs培养液上清中NGF和BDNF的含量；（4）用p75NGFR和S-100免疫荧光抗体双标记检测嗅粘膜及嗅球OECs体外增殖和分化情况。（5）用体外分离培养获得的嗅粘膜OECs和NSCs，直接接触组用24孔培养板、非直接接触组用高通量24孔Transwell培养板共培养OECs和NSCs，单纯NSCs组作为对照组，比较各组NSCs分化为神经元的情况。（6）用体外分离培养的大鼠嗅粘膜OECs和NSCs，将单纯NSCs、Transwell组下层的NSCs、直接接触组OECs和NSCs移植到切割双侧海马伞的SD大鼠双侧海马齿状回中，对照组注射生理盐水。移植后2W、4W、6W和8W行避暗回避试验和跳台试验。然后灌注、取脑和冰冻切片，用BrdU和MAP-2免疫荧光抗体双标记检测移植的NSCs存活和分化情况。结果：（1）嗅粘膜OECs与嗅球OECs在原代培养各时期OECs球的形成、数量和大小无明显差异；（2）扫描电镜显示：嗅粘膜OECs以双极样细胞为主；嗅球OECs的形态有3种：双极样细胞、三极样细胞和扁圆形细胞,其中以对称突起的双极样细胞为主。（3）ELISA测定结果显示：两种OECs上清液中均含有NGF和BDNF，含量随着培养时间的延长而逐渐升高；而培养各相同时期的嗅粘膜OECs分泌的NGF和BDNF浓度与嗅球OECs相比无统计学差异。（4）p75NGFR和S-100免疫荧光双标结果显示：嗅粘膜（OM）和嗅球（OB）组S-100和p75NGFR双标阳性细胞数量均较多，嗅粘膜嗅鞘细胞以双极样细胞为主，其胞体多为细长的梭形，突起细长。嗅球嗅鞘细胞的形态多样，有双极样细胞、三极样细胞和扁圆形细胞，胞体呈长梭形、三角形或圆形。两组OECs的纯化率、胞体面积和细胞周长这三项指标均没有显着性差异。（5）直接接触组和Transwell组MAP-2阳性细胞细胞数量多，较大，突起长而且分枝丰富；直接接触组阳性细胞胞体胞体要明显大于其他两组。直接接触组和Transwell组的MAP-2阳性细胞比例、细胞周长均大于对照组，而直接接触组和Transwell组相比，直接接触组的MAP-阳性细胞周长大于Transwell组，但两组MAP-2阳性细胞比例无明显差异。（6）细胞移植术后行为学检测结果：直接接触组和其他3组大鼠避暗回避试验探索次数和滞留时间相比差异有显着性。移植后6W和8W直接接触组和NSCs组、Transwell组避暗回避试验探索次数比较差异有显着性。3组细胞移植组和对照组大鼠跳台实验的主动及总回避阳性率比较差异有显着性，直接接触组细胞移植术后大鼠的跳台实验主动回避率明显高于NSCs组和Transwell组。两两比较结果：直接接触组分别和NSCs组、Transwell组比较差异有显着性。三组移植细胞进行MAP-2和BrdU免疫荧光检测结果显示：三组移植区脑组织切片中均有MAP-2和BrdU双标阳性细胞，直接接触组和Transwell组中的双标阳性细胞明显多于单纯NSCs组，直接接触组双标阳性细胞的胞体明显大于Transwell组和NSCs组。结论：（1）嗅粘膜OECs与嗅球OECs一样能在体外分离培养和增殖。嗅粘膜OECs以双极样细胞为主，而嗅球OECs的形态多样，有双极样细胞、三极样细胞和扁圆形细胞。嗅粘膜OECs与嗅球OECs均能分泌NGF和BDNF。嗅粘膜OECs与嗅球OECs分化成熟后的形态无明显差异。（2）OECs与NSCs直接接触和非直接接触共培养均能明显提高NSCs向神经元分化的比例。OECs与NSCs直接接触共培养，更能促进神经元的生长和成熟。（3）NSCs组、Transwell组和直接接触组细胞移植入切割海马伞大鼠海马后，能改善模型鼠的认知行为。OECs和NSCs直接接触更能促进NSCs在体内的存活，并向神经元分化。
刘佳[5]（2010）在《细胞移植治疗脊髓损伤的优化方案及PDGF-B在脊髓修复中的作用》文中研究表明【目的】建立三种干细胞即神经干细胞（NSC）、骨髓问充质细胞（BMSC）和造血干细胞（HSC）,及两种支持细胞即嗅鞘细胞（OEC）和雪旺细胞（SC）的体外培养技术,并将两种支持细胞分别和三种干细胞分别联合移植入SD大鼠和猴损伤的脊髓,筛选出细胞联合移植治疗SCI的优化方案,并探讨与其相关的分子表达,找出相对重要的调节分子,研究该分子在SCI中的作用。为寻找细胞移植治疗SCI的有效方法和相关的分子机制提供实验依据,为指导临床应用干细胞移植治疗SCI提供新思路。【方法】1.建立嗅鞘细胞、雪旺细胞、神经干细胞、骨髓间充质细胞和造血干细胞的体外培养技术,并对培养细胞进行鉴定。2.建立SD大鼠脊髓T10全横断损伤模型。将动物分假手术组、单纯脊髓全横断手术组、脊髓全横断手术注射免疫抑制剂组,NSC移植组、BMSC移植组、HSC移植组、SC细胞移植组,OEC移植组,以及NSC+OEC,BMSC+OEC,HSC+SC联合移植组。术后14d沿原切口暴露损伤脊髓,选取距离瘢痕5mm的脊髓上下端和瘢痕各取左右两个位点（脊髓上下端旁开脊髓后正中沟0.5mm,瘢痕处的左右侧位点参照脊髓上下端的左右位点定位）,共6个位点用立体定向仪进行细胞移植（1.0×105/5uL,每个位点）。用5mg/kg/天腹腔注射环孢素（CsA）以减轻细胞移植后的免疫排斥反应。3.后肢运动功能评分:移植术后1～24周,采用双盲法由三名观察人员每周末进行大鼠后肢BBB运动功能评分。最后将三人所得分值求平均分后进行统计学处理。筛选出促进脊髓损伤功能恢复最好的一组为NSC+OEC联合移植组。4.神经电生理检测:对NSC+OEC联合移植组,及其相应对照组进行神经电生理检测,进一步探讨NSC+OEC联合移植组促进SCI的实验依据。（1）运动诱发电位（MEP）的测定采用了神经电生理经颅磁刺激器对NSC+OEC联合移植组14d组,及其对照组假手术组、脊髓全横断手术注射免疫抑制剂组、NSC移植组和OEC移植组的MEP进行检测。3.6%水合三氯乙醛麻醉固定动物后,用盘状电极通过导电膏粘附于大鼠耳朵作为地线,记录电极置于大腿股四头肌,正负电极间距1cm,磁力板中心置于大脑皮质运动区之上刺激大脑皮质,以刺激强度40%刺激大脑皮质,记录股四头肌收集到得电位变化,待波形稳定且重复3次时中止并描记结果。（2）皮层体感诱发电位（CSEP）的测定本实验采用了皮层体感诱发仪（MEDTRONIC公司产品-KEYPOINY）对移植14d的NSC+OEC联合移植组,及其对照组假手术组、脊髓全横断手术注射免疫抑制剂组、NSC移植组和OEC移植组进行了检测。电流为方波脉冲型,刺激电极置于大鼠左下肢胫后神经处,正负电极间距为1cm,参考电极置于大鼠鼻正中皮下,记录电极置于大鼠右侧大脑皮层处皮下,接地电极置于大鼠耳朵。参数设置:扫描速度10ms/D,灵敏度10uv/D,滤波低频10Hz,滤波高频2KHz,刺激强度以引起大鼠后爪抖动为止。每次均记录300次波形后将其叠加平均得到最终的检测结果。5.植入细胞存活检测:在第12和24W末取部分动物用3.6%的水合氯醛进行腹腔注射麻醉,4%的多聚甲醛灌注固定后取材、冰冻切片,荧光显微镜下观察植入细胞存活,迁移。6.PCR扩增疤痕组织的神经营养因子及其受体,和凋亡相关因子:将14d、21d、28d的各组全横断脊髓（手术注射免疫抑制剂组、NSC移植组、OEC移植组和NSC+OEC联合移植组）活体取出疤痕部位及临近组织,匀浆、裂解、提取总RNA、逆转录合成cDNA,进行神经营养因子NGF、BDNF、NT-3、CNTF、PDGF-B、IGF-1、bFGF、TGF-β1,及其受体TrkA、TrkB和TrkC,和凋亡相关因子Bax、Bcl-2、Caspase-3及内参照β-actin的PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。测光密度值,进行统计学分析,筛选出有变化的因子。推测其中与SCI有关的重要分子。7.用高等动物灵长类猴验证NSC+OEC联合移植治疗SCI的效果:建立恒河猴半横断SCI模型。动物分半横断手术注射免疫抑制剂组、NSC移植组、OEC移植组和NSC+OEC联合移植组。通过运动功能评分（1-9周）,神经电生理和核磁共振检测（1月）,和形态学观察来阐明NSC+OEC联合移植对SCI的促进作用。8.选择通过PCR扩增后确定的疤痕组织内有变化的PDGF-B作为切入点:通过免疫组化,RT-PCR,Western Blot,细胞培养,RNA干扰,抗体封闭等技术来研究PDGF-BB在SCI中的作用和可能的作用机制。【结果】1.本实验成功建立了OEC、SC、NSC、BMSC和HSC的体外培养方法,并进行了鉴定。2.运动功能评分:所有大鼠脊髓全横断后,双侧后肢完全瘫痪,不能排尿。大鼠靠前肢拖动身体前行。1周末时,手术损伤组大鼠双后肢开始出现1个后肢关节（踝关节）的轻微活动。细胞移植组则开始出现1或2个后肢关节轻微活动（多为膝关节或/和踝关节）。在第2周末时,手术损伤组和细胞移植组大鼠在细胞移植后排尿障碍均较第1周末时稍有好转,膀胱残余尿仍较多,手术损伤组部分大鼠开始出现2个后肢关节的轻微活动,而细胞移植组部分大鼠开始出现1或2个后肢关节大幅运动。各细胞移植组的大鼠BBB评分在整个恢复的过程中均有明显的提高,但变化最明显的的就是OECs+NSCs组。说明OEC+NSC移植对运动功能恢复明显改善。3.神经电生理感觉和运动诱发电位检测3.1 CSEP检测N1波变化:脊髓全横断组没有测到波形,潜伏期无限延长,与假手术组比较差异显着;说明手术切断脊髓后上行传导通路明显受损。细胞移植后,OEC、NSC移植组均分别能测到N1波,其与SCI组相比较,有显着性统计学差异（P=0.001,≤0.001、P=0.045,＜0.05）。但OEC+NSC移植组分别与OEC组和NSC组比较,均无统计学差异（P=0.720、0.323,＞0.05）。说明OEC+NSC移植对感觉神经生理功能恢复改善不明显。P1波变化:脊髓全横断组亦没有测到波形,说明潜伏期无限延长,与假手术组比较差异显着;然而OEC、NSC移植组能测到P1波,其与SCI组完全消失的情况相比较,差异显着,P=0.001,≤0.001;然而,需注意的是,仅OEC移植组P1波的潜伏期较与假手术组比较明显延长,有统计学差异;而NSC移植组P1波的潜伏期与SCI组相比较,P=0.069,＞0.05,无统计学差异;OEC+NSC移植组P1波的潜伏期与OEC组和NSC组的相比较,P值分别为0.688、0.247,＞0.05,无统计学差异。进一步说明OEC+NSC移植对感觉神经生理功能恢复改善不明显。3.2 MEP检测:本实验中,假手术大鼠均能测到明显的诱发电位,这种诱发电位的波幅为均值在6mv左右,潜伏期5ms左右。而SCI后,波幅和潜伏期均测不到,MEP消失。但给予NSC或者OEC移植后,均能测到MEP。只是其潜伏期有些延长（说明传导速度减慢）,且恢复波幅明显降低（说明突触功能受损）。细胞联合治疗对MEP没有明显影响。4.植入细胞的存活:脊髓切片上可见到GFP标记的绿色荧光细胞。而联合移植组脊髓既可见绿色荧光细胞,又可见Hochest33342标记的细胞核。标记细胞在损伤脊髓瘢痕,及其上段、下端均可见到。说明移植细胞向头、尾侧迁移,并在宿主脊髓存活。5.PCR扩增疤痕组织的神经营养因子及其受体,和凋亡相关因子的表达变化发现:①在疤痕组织中均未检测到BDNF、NT-3、bFGF、TrkA、TrkB表达;②NGF各时间点均没有变化。③凋亡基因变化:Bcl-2:在联合移植21d时与NSC移植组比较明显降低,P=0.011,＜0.05,差异有统计学意义;Caspas-3:联合移植组在14d与NSC移植组、OEC移植组相比较,明显增加（P=0.039、0.032,＜0.05）,差异有显着统计学意义;但至在21d时,联合移植组与NSC移植组比较Caspas-3表达明显减P=0.006,＜0.01,差异有显着统计学意义;在28d时,各处理方式之间比较,差异无统计学意义。Bax在联合移植组14d时与NSC移植比较,明显增加,P=0.031,＜0.05,差异有统计学意义;但至21d时,联合移植组与手术组比较明显减少,P=0.040,＜0.05,差异有统计学意义;在28d时,各处理方式之间比较,差异无统计学意义。④NTF变化:CNTF在联合移植14d时,与OEC移植组及NSC移植比较表达明显增加,P值分别为0.007、0.001、0.023,均＜0.05,差异有显着统计学意义;在21d,联合移植组与NSC移植组比较明显减少,P值为0.000,＜0.01,差异有显着统计学意义;在28d,联合移植组与OEC移植组、NSC移植组比较均明显减少,P值分别为0.028、0.028,均＜0.05,差异有显着统计学意义。IGF-1:在14d时,联合移植组与OEC移植组及NSC移植比较,明显增加,尸值分别为0.003、0.001,均＜0.05,差异有显着性统计学意义;而在21d和28d时,各处理方式之间比较,差异均无统计学意义;PDGF-B:在14d时,联合移植组、OEC、NSC移植与手术组比较,明显减少,P=0.044,＜0.05,差异有统计学意义;联合移植组与NSC移植比较,明显减少,P=0.047,＜0.05,差异有统计学意义。在21d时,联合移植组与NSC移植组、OEC移植组及手术组比较明显减少,P=0.039、0.039、0.031,＜0.05,差异有统计学意义。在28d时,联合移植组与OEC移植组之间比较显着减少,P=0.011,＜0.05,差异有统计学意义。TGF-betal:在14d时,联合移植组与NSC移植组、OEC移植组和手术组比较明显增加,p=0.001、0.019、0.001,＜0.05,差异有统计学意义;而在21d和28d时,各处理方式之间比较,差异无统计学意义。Trkc:在14d时,联合移植组与NSC移植组比较,明显降低,P值分别为0.031,＜0.05,差异有统计学意义;在21时,联合移植组与手术组比较（P=0.015,＜0.05）,和NSC移植组比较（P=0.010,＜0.05）。差异有统计学意义,而在28d时,各处理方式之间比较,差异无统计学意义。可以看出,PDGF-B是细胞移植促进损伤脊髓修复中变化最明显的分子,提示其可能是细胞移植改进功能可塑性相关的重要分子。6.OEC+NSC移植对恒河猴SCI功能恢复的影响6.1后肢运动功能评分:改良的Tarlov’s Method评分结果显示损伤侧、细胞联合移植侧评分均较假手术组明显降低,有统计学差异（P＜0.05）。第1周、第2周、第3周、第4周、第7周,OEE+NSE移植细胞联合移植侧Tarlov’s Method评分均明显高于损伤侧评分,均有统计学意义（P＜0.05）。6.2移植细胞在宿主脊髓存活和迁移情况:在宿主脊髓可观察到大量荧光细胞,向头端或尾端迁徙;说明移植细胞在宿主脊髓存活,迁移。6.3神经电生理:CSEP:SCI后各组动物的CSEP信号均消失。损伤侧N1波波幅明显低于损伤对侧,有统计学差异（P＜0.05）;而NSC联合OEC细胞移植1个月,细胞联合移植侧N1波幅明显高于损伤侧,有统计学意义（P＜0.05）;MEP:SCI后各动物MEP信号均消失。而细胞移植1个月能检测到MEP,只是损伤侧损伤平面以下节段MEP的波幅明显低于损伤侧损伤平面以上节段的MEP波幅,有统计学差异（P＜0.05）;而损伤侧与细胞联合移植侧测得的波幅相比较没有明显差异,没有统计学意义（P＞0.05）。比较之,损伤侧损伤平面以上节段测得的潜伏期较损伤侧损伤平面以下节段测得波幅明显延长,有统计学差异（P＜0.05）;而细胞联合移植测得的潜伏期较损伤侧测得的潜伏期明显缩短,有统计学差异（P＜0.05）。6.4 MRI:脊髓左侧半横断+细胞移植瘢痕横切面积明显小于单纯脊髓左侧半横断组脊髓损伤对照节段面积,有统计学差异（P＜0.05）;而脊髓损伤上1节段和损伤下1阶段脊髓横切面面积无明显差异,均没有统计学差异（P＞0.05）。7.PDGF-B在大鼠脊髓全横断损伤后的变化和作用研究:SCT后1天直至损伤后28天,PDGF-B蛋白质和mRNA在损伤脊髓中明显上调。PDGF-B免疫反应的产物分布在疤痕星型胶质细胞中。同时星型胶质细胞明显增值,疤痕组织内的PDGF-B信号分子转录激活因子3（STAT-3）的上调相一致。通过PDGB-B抗体封闭和iRNA对PDGF-B活性分别在蛋白水平和基因水平进行阻断和干扰,导致以下几方面的显着改变:（1）显着下调了PDGF-B下游信号分子的水平;（2）显着减少了星形细胞胶质增生和疤痕的形成;（3）增加轴突再生和出芽;（4）后肢运动功能和感觉功能的显着改善。【结论】1本实验通过不同的细胞组合治疗方法,在低等啮齿类动物SD大鼠和高等灵长类动物恒河猴SCI模型上证明了NSC联合OEC移植能够最有效促进损伤脊髓的运动功能恢复。是目前较为乐观的有效策略。移植细胞能够在大鼠和猴损伤脊髓长时间存活、迁徙。NSC联合OEC移植作为一种治疗SCI的有效方法,具有潜在的临床应用价值。2 NSC联合OEC移植有效促进损伤脊髓的运动功能恢复与多种细胞因子的表达调节有关。其中PDGF-B是较重要的分子。3 PDGF-B蛋白和基因干扰,能显着减少了星形胶质增生,抑制疤痕形成,促进轴突再生,并改善后肢运动功能。从而证明PDGF在SCI修复中是一个关键的调节分子。
李云[6]（2010）在《NSC和OEC联合移植对SCT大鼠大脑皮质运动区神经元的作用及相关机制研究》文中提出【目的】探讨NSC和OEC联合移植对脊髓全横断损伤大鼠的运动功能及大脑皮质运动区神经元的保护作用,并探讨其作用机制。【方法】采用细胞培养、免疫组织化学、TUNEL法、蛋白质印迹法和逆转录聚合酶链式反应等技术,结合动物行为学观察（BBB评分及运动诱发电位检测）,研究全横断脊髓损伤及NSC和OEC联合移植后,损伤大鼠运动功能的变化、大脑皮质运动区神经元的存活与凋亡、相关凋亡基因表达变化及其信号转导分子的调节。【结果】1.T9全横断脊髓损伤后,大鼠后肢运动功能完全丧失,随时间延长,有一定的（甚至无）自发性恢复,但此种自发性恢复能力非常有限。在脊髓全横断损伤后的1～4周的各个时间点,手术组大鼠BBB评分明显低于假手术组（P＜0.001）。术后4周,手术组80%的大鼠未检测到MEP,20%的大鼠检测到波幅极低的MEP波形;假手术组MEP检出率为100%,波幅、潜伏期正常。细胞凋亡TUNEL检测显示:术后2周,手术组大脑皮质V层TUNEL阳性细胞数较假手术组增多（P＜0.05）。免疫组化结果表明:术后4周,手术组大脑皮质V层NeuN阳性细胞数较假手术组减少（P＜0.05）;同时,手术组Bax和Caspase-3的阳性细胞数较假手术组明显增多（P＜0.05）,而Bcl-2两组相比无统计学差异（P＞0.05）。RT-PCR结果显示:大脑皮质运动区Bax的表达在手术组各时间点与假手术组比较均无差异（P＞0.05）;而Bcl-2的表达术后14天和28天较假手术组明显减少（P＜0.05）;Caspase-3则在术后3天较假手术组表达高（P＜0.05）,其他时间点接近假手术组水平。2.从细胞移植术后第3周末开始,NSC和OEC联合移植组大鼠后肢运动功能的恢复明显优于单纯全横断组（P＜0.05）;三个细胞移植组大鼠的BBB评分在整个恢复过程中均有明显的提高,其中NSC和OEC联合移植组的BBB分值在第3周末高于NSC移植组和OEC移植组,在第4周末高于NSC移植组（P＜0.05）;NSC移植组和OEC移植组的BBB评分在移植术后第4周末高于单纯全横断组（P＜0.05）。细胞移植术后4周,各细胞移植组均有不同程度的MEP波幅,但均明显低于假手术组（P＜0.01）;NSC和OEC联合移植组的所有受试动物均检测到MEP波形,检出率达100%,NSC和OEC单独移植组MEP检出率均为50%。细胞移植后2周,假手术组和各细胞移植组大鼠大脑皮质V层TUNEL阳性染色细胞较单纯全横断手术组少（P＜0.05）;联合移植组较OEC移植组细胞凋亡数少（P＜0.05）。细胞移植术后4周,免疫组化结果显示:尽管全横断损伤组、NSC和OEC单独移植组的NeuN阳性细胞数较假手术组明显减少（P＜0.05）,而NSC和OEC联合移植组与假手术组相比却无明显差异（P＞0.05）,说明细胞联合移植可减轻皮质运动神经元的凋亡。结果还发现:联合移植组大脑皮质V层抗凋亡因子Bcl-2阳性细胞数较各对照组多（P＜0.05）;而联合或单细胞移植组促凋亡基因Bax阳性细胞数均较手术组减少（P＜0.05）;Caspase-3阳性细胞数仅联合移植组和OEC移植组较手术组减少,且联合移植组较两种细胞单一移植组减少明显（P＜0.05）。RT-PCR检测发现:NSC和OEC联合移植后3天,Bax mRNA的表达较NSC移植组增多,但较OEC移植组降低（P＜0.05）;而在联合移植后14天和21天,Bcl-2的表达较OEC移植组增高（P＜0.05）;Caspase-3的表达在移植后3天和7天较手术组表达降低（P＜0.05）,移植后14天,较NSC移植组表达降低（P＜0.05）。3.信号通路分子RT-PCR检测显示:细胞移植术后3天,联合移植组、OEC移植组和手术组大脑皮质运动区PKB mRNA的表达均明显高于NSC移植组（P＜0.05）,手术组还较假手术组表达高（P＜0.05）;而术后14天,NSC移植组PKB mRNA的表达明显回升且显着高于OEC移植组（P＜0.05）;移植术后21天,NSC和OEC联合移植组PKB mRNA的表达较NSC移植组和OEC移植组高（P＜0.05）,其中,OEC移植组还低于手术组和假手术组（P＜0.05）。术后7天和28天,各组比较无差异（P＞0.05）。比较之,单独和联合移植术后ERK1mRNA的表达在各时间点均较假手术组和手术组明显减低（P＜0.01）;且术后3天,NSC移植组高于OEC移植组和联合移植组（P＜0.01）。Stat-3 mRNA的表达则表现为细胞移植术后3天,联合移植组和OEC移植组较假手术组及手术组表达高（P＜0.05）;移植术后14天手术组较假手术组降低（P＜0.05）,而各细胞移植组均较手术组明显升高（P＜0.05）;在细胞移植术后21天,各细胞移植组Stat-3的表达均较假手术组降低（P＜0.05）;而在移植术后28天,NSC移植组Star-3较假手术组和联合移植组表达增高（P＜0.05）。进而,Western-blot检测结果发现:移植术后14天,联合移植组Akt非磷酸化蛋白、ERK1/2磷酸化蛋白的表达均比手术组和假手术组高,且Akt非磷酸化蛋白在NSC移植组比手术组表达高（P＜0.05）。联合移植组非磷酸化Stat-3的表达较假手术组、手术组、NSC移植组表达高（P＜0.05）;Akt磷酸化蛋白、Stat-3磷酸化蛋白和ERK1/2非磷酸化蛋白的表达各组间比较均无差异（P＞0.05）。4.体外共培养显示:NSC和OEC共培养7天,联合培养组NeuN阳性细胞数较NSC单独培养组多（P＜0.05）,而未分化的Nestin阳性细胞较单独培养组低（P＜0.05）;GFAP和APC阳性细胞分化率两组比较无差异（P＞0.05）。提示OEC可能促进NSC向神经细胞分化。【结论】1.脊髓全横断损伤后可能有部分自主运动功能恢复,但非常有限,需要寻找有效的治疗措施;脊髓全横断损伤引发大脑皮质运动区神经元凋亡基因表达失控,进而导致细胞凋亡,因此,脊髓损伤的研究必须考虑到脊髓自身以外的损害,特别是大脑皮质。2.NSC和OEC作为两种有用的“种子”细胞,其单独和联合移植能有效促进脊髓损伤大鼠运动功能部分恢复,且联合移植优于单细胞移植。3.NSC和OEC联合移植发挥作用的机制可能涉及:①OEC能促进NSC的增殖和向神经元分化;②减少大脑皮质运动区神经元凋亡;③促进抗凋亡因子Bcl-2的基因和蛋白质表达;④调节ERK1/2信号转导通路。
吕昕刚[7]（2010）在《嗅鞘细胞静脉移植治疗脊髓损伤的实验研究》文中研究表明脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）后的神经再生及功能恢复一直是医学界的难题,近年来在细胞移植中,嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells, OECs）以其独特的生物学特性和促进损伤脊髓轴突再生的作用成为最有前景的治疗方法之一。目前嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的方式以局部移植治疗为主,而以静脉移植治疗脊髓损伤的方式没有检索到相关的研究报道。目的探讨和研究嗅鞘细胞静脉移植治疗急性脊髓损伤的疗效（感觉运动功能恢复、神经纤维再生情况等）及可能的作用机制,为临床上治疗急性脊髓损伤提供一种简单易行的移植方法。材料与方法1.嗅鞘细胞的培养、纯化与鉴定：取两个月左右健康wistar大鼠的嗅球,雌雄不限,体重200-250g,进行OECs的原代培养、纯化,消化收集嗅鞘细胞,并用双苯亚甲胺进行核标记。2.脊髓半切损伤模型的制备、分组与移植治疗：40只健康成年Wistar大鼠,制备右侧T10脊髓半切损伤模型。将大鼠模型随机分为嗅鞘细胞髓内局部移植组（A组）、嗅鞘细胞静脉移植组（B组）、D/F12静脉移植组（C组）和空白对照组（D组）。3.脊髓损伤功能恢复的评价：移植术后1天、1周、2周、3周、5周、7周、10周分别进行肢体运动功能评分（改良CBS评分）观察动物模型运动功能情况；术后5周、10周取材脊髓标本,先行大体形态学观察,再行HE染色和嗜银染色,观察脊髓损伤部位神经轴突的再生情况,免疫组化染色及荧光显微镜观察标记细胞在脊髓损伤部位的存活、分布情况。结果应用差速贴壁和Ara-c抑制相结合的纯化培养方法培养出纯度较高的嗅鞘细胞,胞体为梭形、扁圆形和多突起形三种形态,呈NGFRP75和GFAP染色阳性反应。移植术后1-10周各时段,大鼠后肢运动功能均有不同程度的恢复,10周时A、B、C、D组CBS评分分别为8.2±1.874、14.60±3.273、35.90±2.234、35.80±4.290。3周后评分显示,B组和A组同C组和D组间比较,各时段的差别均有显着意义（P<0.01）,B组与A组疗效相似,C组与D组间无显着差异（P>0.05）。HE染色和嗜银染色见B组和A组均有较多的再生轴突,并有神经纤维通过损伤区,A组再生的轴突多于B组,C组与D组仅有极少散在的再生轴突,无连续性神经纤维通过损伤区。免疫组化染色在损伤区可观察到存活的嗅鞘细胞,分布于整个损伤区,而在存活的数量上A组比B组多。结论1.差速贴壁和Ara-c抑制相结合的培养方法兼收了两者的优点,能获到较高纯度的嗅鞘细胞,满足细胞移植所用,实际应用效果好；2.嗅鞘细胞静脉移植治疗急性脊髓损伤,其疗效与髓内局部移植相似,受损神经功能有一定程度的恢复,且移植的嗅鞘细胞可在脊髓损伤区存活并迁移；3.嗅鞘细胞静脉移植操作简单易行,可多次重复治疗,并能避免再次手术造成的脊髓二次损伤及术后诸多并发症,有较好的临床推广和使用价值。
尹国栋[8]（2009）在《表达NgRs的活化巨噬细胞在大鼠脊髓损伤修复中的作用机制》文中进行了进一步梳理一、研究背景脊髓损伤后（Spinal cord injury,SCI）轴突难以有效再生是脊髓损伤研究的难点之一,这与脊髓损伤后周围环境中存在不利于轴突生长的抑制因子有关。近年来,髓鞘相关抑制分子如Nogo-A、髓鞘相关糖蛋白（Myelin-associated glycoprotein,MAG）、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（Oligodendrocyte-myelin glycoprotein,OMgp）及Nogo-66受体（Nogo-66 receptors,NgRs）介导的信号转导途径的相继发现深化了人们对SCI轴突再生分子机制的认识,同时也找到了SCI治疗研究新的切入点,以Nogo或NgRs为靶点的治疗成为脊髓损伤研究新的热点。然而,迄今为止,相关实验研究仍未取得突破性进展:单克隆抗体IN-1可以拮抗Nogo的抑制作用,但无法与另外两种抑制物MAG和OMgp结合;NgRs的竞争性短肽NEPI-40可对抗Nogo-66诱导的轴突生长抑制作用,但对除Nogo-66外的其他髓鞘抑制物不敏感。因此,找到另一种更有效清除髓鞘抑制因子的办法成为当务之急。巨噬细胞是人体内的炎性细胞,在创伤修复过程中起着重要作用。目前,对巨噬细胞在中枢神经系统损伤修复中的作用,人们的认识并不一致:一种认为巨噬细胞对轴突生长有抑制作用;另一种则认为巨噬细胞对轴突的再生起到促进作用。既往观点认为,中枢神经系统的无菌性炎症反应是有害的,尤其对于SCI后的反应。然而,在整个机体组织的修复过程中,炎性反应贯穿始终,而炎性细胞中,巨噬细胞发挥了主要作用,它能清除坏死组织并分泌营养因子,在所有机体组织修复中起着重要作用。近期研究显示,巨噬细胞在髓鞘碎片吞噬、促进轴突再生及再髓鞘化过程中发挥的作用可能超出我们的预期。1998年,Zeev-Brann报道成熟哺乳动物中枢神经系统损伤后的自我修复过程中发现了骨髓衍生炎性细胞;随后,2003年,Buss等发现巨噬细胞在局部的延迟浸润与脊髓挫伤后髓鞘碎片的持续存在密切相关,并且可导致轴突再髓鞘化过程受抑制。2007年,Samuel David等则进一步证实,巨噬细胞是否表达NgRs及其浸润与撤离过程关系到轴突再髓鞘化过程能否顺利进行,并进而影响脊髓神经细胞的生理机能恢复。二、研究目的分离、培养、鉴定大鼠脊髓损伤局部巨噬细胞,并对其形态、生长特点等生物学特性进行研究,观察其是否表达NgRs;研究原代神经干细胞（neural stem cells,NSCs）及嗅鞘细胞（Olfactory ensheathing cells, OECs）等的体外分离方法、细胞培养体系,探讨巨噬细胞、神经干细胞及嗅鞘细胞的移植应用可行性;将表达NgRs的巨噬细胞与神经干细胞联合移植到脊髓全横断损伤大鼠模型体内,并与嗅鞘细胞、神经干细胞等不同移植组比较,观察其对移植神经干细胞存活、分化、突触形成及大鼠脊髓神经功能恢复情况的影响,探讨表达NgRs的巨噬细胞在脊髓损伤修复中的可能作用机制,为进一步动物研究及临床应用提供实验和理论依据。三、内容和方法（一）用酶消化法分离获取大鼠脊髓损伤局部原代巨噬细胞,对其进行生物学鉴定,观察其细胞形态、生长特点,使用免疫荧光化学染色观察其NgRs表达情况;（二）分离新生大鼠嗅球,解剖显微镜下选取嗅球最外二层进行酶解后培养,利用延迟差速贴壁法结合阿糖胞苷抑制剂法对嗅鞘细胞进行纯化,用免疫细胞化学方法鉴定不同时期嗅鞘细胞的纯度;（三）无菌条件下分离鼠胚脑组织,使用含DNA酶的胰蛋白酶消化后制作神经干细胞单细胞悬液,DMEM/F12培养基悬浮培养,观察其细胞学特点与生长曲线,添加诱导剂后观察其分化情况;（四）选取细胞活力旺盛的原代巨噬细胞、嗅鞘细胞及神经干细胞,调整细胞浓度,hoechst33342标记神经干细胞;将脊髓全横断模型大鼠分为4组,分别移植巨噬细胞和NSCs悬液、OECs和NSCs悬液、NSCs悬液、DMEM/F12培养液;观察术后各组神经干细胞存活、分化、突触形成及大鼠BBB运动功能评分等各项指标。四、研究结果（一）原代培养的巨噬细胞1小时后迅速贴壁生长,细胞形态呈圆形、椭圆形等,体积大,胞浆丰富,培养1～2周内细胞活动旺盛,免疫荧光化学染色显示CD68抗原阳性,多数细胞NgRs抗原阳性;（二）原代培养5d的OECs胞体呈长梭形,多极状,立体感强,折光性好。8d后,胞体变大,突起变长,并逐渐相互交织成网。14d后细胞主要表现为双极、三极形态,贴壁第2、7d的细胞染色,P75阳性达到95%以上,随后阳性率逐步下降,第14d细胞染色阳性率降至90%。25d则仅为50%;（三）原代培养的神经干细胞呈球团状悬浮生长,球体折光性好,边缘毛躁,细胞排列整齐,高倍镜下可见神经球周边毛刺状的细小突起,细胞生长速度较快。免疫细胞化学染色提示Nestin抗原阳性,添加血清诱导后,可分化成NF-200及GFAP抗原阳性细胞。（四）表达NgRs的巨噬细胞与神经干细胞联合移植4W后,SCI大鼠BBB运动功能评分明显高于对照组、NSCs组及OECs、NSCs联合移植组,具有统计学差异（P<0.05）,且随着时间延长差异更显着;同时,荧光显微镜下观察到该组hoechst33342标记神经干细胞荧光强度及密度也较其余三组高,该组免疫组织化学染色可观察到更多的NF-200阳性细胞及Synaptophysin抗体染色阳性细胞。五、实验结论成功地从脊髓损伤局部分离出表达NgRs抗原的巨噬细胞,对其细胞学特性及生物学特性获得一定了解,获得足够数量的NSCs及OECs,为实验研究提供了理想的移植材料;表达NgRs的巨噬细胞能改善脊髓轴突再生微环境,提高移植神经干细胞的生存率和神经元分化率,有利于神经细胞突起间突触的形成,进而促进损伤脊髓的神经功能恢复。其机制可能是巨噬细胞通过表达的NgRs介导胞内信号途径调节对髓鞘等坏死组织的吞噬作用,从而为神经再生创造条件。这为脊髓损伤的治疗研究提供了一个新的解决途径,也为进一步动物研究和临床应用奠定了可靠的实验基础和理论依据。
黄良[9]（2008）在《大鼠胸髓半横断后腰髓前角的突触可塑性研究》文中研究说明第一部分大鼠胸髓半横断后后肢运动功能自发性恢复目的:通过斜板实验、Tarlov评分和BBB评分方法相结合进行脊髓损伤后运动功能综合评价来研究胸髓半横断后后肢运动功能恢复程度。方法:66只成年健康SD大鼠随机分为实验组、假手术组和正常对照组。实验组和假手术组按术后存活期分为12h、3d、7d、14d和21d亚组。实验组动物在T10处横断右侧半脊髓,假手术组大鼠在相同部位只进行椎板切除,正常对照组不做任何处理。在各存活时间点通过斜板实验、Tarlov评分和BBB评分综合评价胸髓半横断后后肢运动功能。结果:大鼠胸髓半横断后12h时,后肢运动功能完全丧失,斜板实验、Tarlov评分和BBB评分这三种评分急剧下降（p＜0.05）,从3d开始,后肢功能逐渐恢复,评分结果增加,至21d时斜板实验、Tarlov评分和BBB评分这三种评分与正常接近,运动功能基本恢复正常。结论:大鼠胸髓半横断后后肢运动功能出现自发性恢复。第二部分大鼠胸髓半横断后腰髓前角的突触可塑性变化目的:在第一部分观察到有后肢运动功能自发性恢复的基础上,通过检测胸髓半横断后腰髓突触囊泡素（synaptophysin,SYN）的表达变化,研究腰髓前角运动神经元和中间神经元的突触可塑性变化。方法:实验分组和动物模型与第一部分相同。实验动物在处死前5天经坐骨神经注射荧光金（fluorogold,FG）,通过SYN免疫荧光反应检测腰髓（L5）节段运动神经元周围的突触囊泡素的表达变化,用维生素D依赖性钙结合蛋白（Calbindin D28k,CB）或钙网蛋白（Calretinin,CR）和SYN免疫荧光双标方法检测L5节段中间神经元周围的SYN的表达变化。另取实验动物（n=66）用Western Blot方法检测L5节段SYN蛋白表达改变。并对后肢运动功能BBB评分与腰髓损伤侧SYN蛋白表达、前角运动神经元和中间神经元周围的SYN表达水平进行相关分析和回归分析。结果:胸髓半横断后,腰髓运动神经元和中间神经元周围的SYN表达呈现损伤早期减少后期增加的趋势:损伤后12h时CR-ir神经元周围的SYN-ir降低,3d时恢复至正常水平。CB-ir神经元周围的SYN表达在损伤后3d时才开始下降。而运动神经元周围的SYN表达在损伤后12h时下降,3d才开始轻微回复,然后维持其表达水平,至21d才增加至稍高于正常,在时相上明显晚于中间神经元的改变。Western blot结果显示腰髓损伤侧SYN蛋白表达早期没有明显变化,直至21d才增加。相关分析显示后肢运动功能BBB评分与腰髓损伤侧SYN蛋白表达总量之间r=0.42（p=0.003）,BBB评分与运动神经元周围的SYN表达水平之间r=0.33（p=0.02）,BBB评分与CR-ir神经元周围的SYN表达水平之间r=0.45（p=0.001）;而回归分析显示BBB评分有20%的可能是由腰髓SYN蛋白表达总量（r2=0.20）或15%的可能是由运动神经元周围的SYN表达变化引起（r2=0.15）或19%的可能是由CR-ir神经元周围的SYN表达变化引起（r2=0.19）。提示后肢运动功能BBB评分与腰髓损伤侧SYN蛋白表达总量和CR-ir神经元周围的SYN表达水平之间呈正相关。结论:胸髓半横断后腰髓运动神经元和中间神经元出现突触可塑性改变,这些改变具有时相特征,而且后肢运动功能恢复与腰髓损伤侧SYN蛋白表达或运动神经元或CR-ir中间神经元的可塑性改变呈正相关。第三部分大鼠胸髓半横断后腰髓可塑性变化的可能机制目的:研究大鼠胸髓半横断后运动神经元和中间神经元突触可塑性变化的可能机制。方法:54只SD大鼠随机分为实验组、假手术组和正常对照组。实验组动物行T10脊髓节段右侧半横断。假手术组动物仅行相同部位的椎板切除术。正常对照组不做任何处理。三组动物均于第7d分别在左侧、右侧运动皮质后肢区或C4双侧灰质区进行生物素葡聚糖胺（biotinylated dextran,BDA）顺行示踪,第21d时处死,通过BDA顺行示踪和CR/小白蛋白（parvalbumin,PV）/SYN免疫荧光双标检测颈髓（C5）节段的BDA阳性产物与CR/PV-ir神经元的关系以及L5节段的BDA阳性产物与SYN免疫阳性产物或CR/PV-ir神经元的关系。结果:胸髓半横断后21d时颈髓双侧可见BDA标记的皮质脊髓束侧枝增加,并且这些侧枝与CR/PV-ir的中间神经元形成联系;同时腰髓损伤侧还可观察到BDA标记的长脊髓固有束神经元（longpropriospinal neuron,LPN）轴突与SYN双标,并与CR/PV-ir的中间神经元形成联系。结论:胸髓半横断后21d时受损和未受损的皮质脊髓束发出侧枝经颈髓中间神经元中继或直接经LPN轴突与腰髓的中间神经元和运动神经元建立联系,这种新的环路的建立可能是大鼠胸髓半横断后运动功能恢复的形态学依据。
张卫民[10]（2007）在《干细胞源性胆碱能样细胞对全横断损伤脊髓修复的影响》文中研究说明【目的】探讨绿色荧光蛋白（GFP）转基因胎鼠海马源性神经干细胞（NSCs）向胆碱能样细胞诱导及移植入全横断脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）大鼠脊髓后，动物后肢运动和感觉功能的变化，并观察移植细胞的存活和迁移情况，为NSCs移植用于SCI治疗提供理论和实验依据。【方法】体外将GFP转基因胎鼠海马源性NSCs定向诱导为胆碱能样细胞，立体定向移植入急性期（手术当天）和慢性期（术后7天）全横断损伤大鼠脊髓头侧和尾侧，在4周内每周末用行为学BBB运动功能评分评估大鼠后肢运动功能的变化，用针头刺激大鼠后肢评估感觉功能的变化，之后取脊髓行冰冻切片在倒置荧光显微镜观察移植细胞的存活和迁移情况，并行组织学及免疫组化染色。使用SPSS11.5软件包对数据进行统计学处理。【结果】1．单纯脊髓全横断手术损伤组大鼠BBB运动功能评分随术后时间延长缓慢增高。表明脊髓全横断损伤后，大鼠后肢运动功能有部分恢复。2．NSCs急性期和慢性期在SCI位点头侧移植组BBB评分分别较手术损伤组显着增高（P＜0.05），而尾侧移植组分别与手术损伤组比较无明显差异（P＞0.05）。NSCs头侧和尾侧慢性期移植组BBB评分分别较对应急性期移植组显着增高（P＜0.05）。NSCs急性期和慢性期头侧移植组分别较对应尾侧移植组显着增高（P＜0.05）。3．与对应NSCs移植组分别比较，除胆碱能样细胞慢性期尾侧移植组BBB评分显着增高（P＜0.05）外，慢性期头侧和急性期头尾侧移植组无明显差异（P＞0.05）。胆碱能样细胞头侧慢性期移植组BBB评分与对应急性期移植组比较无明显差异（P＞0.05），而尾侧慢性期移植组较对应急性期移植组显着增高（P＜0.05）。胆碱能样细胞急性期头侧移植组BBB评分较对应尾侧移植组显着增高（P＜0.05），而慢性期头侧移植组与对应尾侧移植组比较无明显差异（P＞0.05）。4．全横断SCI后大鼠后肢感觉功能细胞移植组较手术损伤组好。5．移植入的NSCs和诱导后的胆碱能样细胞在宿主脊髓内存活，并通过脊髓横断处向头侧和尾侧迁移。【结论】1．大鼠在全横断SCI后存在部分自主运动功能恢复。2．GFP转基因胎鼠海马源性NSCs及其在体外定向向胆碱能样细胞分化诱导后可用于移植治疗大鼠脊髓全横断性损伤，改善大鼠后肢运动功能，两者均有慢性期移植优于急性期，头侧移植优于尾侧，且胆碱能样细胞移植优于NSCs移植。3．全横断SCI后，细胞移植组大鼠后肢感觉功能较手术损伤组有一定的改善。4．移植细胞在全横断脊髓宿主内存活、迁移良好，其机制可能与移植的NSCs分泌神经营养因子及诱导后的胆碱能样细胞增加了损伤区表达胆碱乙酰转移酶（ChAT）的胆碱能细胞的数量有关。
二、嗅神经鞘细胞移植修复成鼠半横断胸髓损伤（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、嗅神经鞘细胞移植修复成鼠半横断胸髓损伤（论文提纲范文）
（1）仿生静电纺水凝胶纤维束支架用于脊髓损伤修复的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 GELMA水凝胶生物支架的制作及其材料结构和性能表征 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第二部分 GELMA水凝胶生物支架促进BMSCS和神经元的粘附和体外迁移的研究 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第三部分 CELMA水凝胶生物支架促进脊髓损伤修复的研究 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、结果 |
| 四、结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 明胶及甲基丙烯酸化水凝胶的制备及应用 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 攻读学位期间已发表的论文、专利和学术获奖 |
| 主持或参与的科研项目 |
| 参加学术会议情况 |
| 致谢 |
（2）NSCs与PLGA复合体移植对大鼠脊髓半横断损伤的修复作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写对照 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料与仪器 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 乳鼠NSCs的分离和培养的优化 |
| 2.1.1 原代NSCs的培养 |
| 2.1.2 NSCs的传代、鉴定及诱导分化 |
| 2.1.3 NSCs的冻存、复苏及存活率检测 |
| 2.1.4 NSCs的克隆增殖能力 |
| 2.1.5 优选合适的NSCs的培养方法 |
| 2.2 NSC与PLGA复合体移植治疗SD大鼠脊髓半横断损伤修复作用 |
| 2.2.1 NSCs与缓释的复合体移植物的构建 |
| 2.2.2 实验动物分组和大鼠脊髓半横断损伤的建立 |
| 2.2.3 NSC与PLGA复合体移植治疗SD大鼠脊髓半横断损伤 |
| 2.2.4 NSCs+PLGA复合体移植治疗大鼠脊髓半横断损伤效果评价指标 |
| 2.3 统计学方法 |
| 结果 |
| 1.乳鼠NSCs的分离和培养的优化 |
| 1.1 两组NSCs形态学观察 |
| 1.2 两组NSCs的鉴定和诱导分化 |
| 1.3 两组NSCs的增殖能力 |
| 2.NSCs与PLGA复合体移植治疗大鼠脊髓半横断损伤效果修复作用 |
| 2.1 BBB评分 |
| 2.2 IP评分 |
| 2.3 电生理：MEPs检测 |
| 2.4 HE染色病理学结果 |
| 讨论 |
| 1.乳鼠NSCs分离和培养的优化 |
| 2.实验动物模型的选择和移植时间的选择 |
| 3.PLGA组织工程支架的优越性 |
| 4.NSCs与PLGA复合体移植治疗大鼠脊髓半横断损伤效果观察 |
| 4.1 BBB评分评价 |
| 4.2 IP评分评价 |
| 4.3 电生理评估：MEPs评价 |
| 4.4 病理学:HE染色评价 |
| 5.总结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅 |
（3）牛膝多肽对单侧坐骨神经横断诱导的脊髓和背根神经节细胞凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 第二章 建立脊髓细胞凋亡的动物模型 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 主要实验试剂及溶液的配制 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 第三章 牛膝多肽对单侧坐骨神经横断后脊髓和背根神经节细胞凋亡的影响 |
| 材料和方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 主要实验试剂及溶液的配制 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 在攻读硕士学位期间公开发表的论文与参加的项目 |
| 致谢 |
（4）神经干细胞和嗅粘膜嗅鞘细胞共培养及移植治疗切割海马伞大鼠的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 大鼠嗅粘膜和嗅球嗅鞘细胞体外分离培养比较 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第二部分 大鼠神经干细胞和嗅粘膜嗅鞘细胞共培养对神经干细胞分化为神经元的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第三部分 神经干细胞和嗅粘膜嗅鞘细胞移植治疗切割海马伞大鼠的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表（Abbreviation） |
| 博士生期间完成的论文 |
| 博士生期间承担科研项目情况 |
| 致谢 |
（5）细胞移植治疗脊髓损伤的优化方案及PDGF-B在脊髓修复中的作用（论文提纲范文）
| 中英文对照索引 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 |
| 一、神经干细胞体外培养技术的建立 |
| 参考文献 |
| 二、骨髓基质干细胞培养技术建立 |
| 参考文献 |
| 三、骨髓造血干细胞的体外培养 |
| 参考文献 |
| 四、嗅鞘细胞培养 |
| 参考文献 |
| 五雪旺细胞的体外培养 |
| 参考文献 |
| 第二部分 |
| 一 材料与方法 |
| 二.实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 |
| 材料和方法 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 博士期间发表的论文和参编教材 |
| 参加科研项目 |
| 博士期间获奖情况 |
| 致谢 |
（6）NSC和OEC联合移植对SCT大鼠大脑皮质运动区神经元的作用及相关机制研究（论文提纲范文）
| 主要缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 正文 |
| 引言 |
| 第一部分 全横断脊髓损伤对大鼠运动功能及大脑皮质运动区神经元的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 NSC和OEC联合移植对全横断脊髓损伤大鼠运动功能及大脑皮质运动区神经元的保护作用研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 NSC和OEC联合移植对全横断脊髓损伤大鼠大脑皮质运动区神经元保护作用的分子信号通路研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 |
| 文献综述二 |
| 攻读博士研究生期间发表的文章 |
| 致谢 |
（7）嗅鞘细胞静脉移植治疗脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（8）表达NgRs的活化巨噬细胞在大鼠脊髓损伤修复中的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写一览表 |
| 绪论 |
| 第一部分 脊髓损伤局部表达 NgR 的巨噬细胞的体外分离培养 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 鼠嗅鞘细胞体外培养的实验研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 大鼠胚胚神经干细胞的体外分离培养 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 表达NgR 的巨噬细胞与神经干细胞联合移植修复大鼠脊髓全横断损伤 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（9）大鼠胸髓半横断后腰髓前角的突触可塑性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠胸髓半横断后后肢运动功能自发性恢复 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 动物模型制备 |
| 1.1.2 神经功能评价标准 |
| 1.1.3 结果观察与分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 神经功能检测 |
| 1.3 讨论 |
| 第二部分 大鼠胸髓半横断后腰髓前角的突触可塑性变化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 动物模型制备 |
| 2.1.2 坐骨神经FG逆行示踪 |
| 2.1.3 组织制备 |
| 2.1.4 腰髓SYN免疫荧光染色 |
| 2.1.5 腰髓CB/CR与SYN免疫荧光双标染色 |
| 2.1.6 蛋白质免疫印迹(Western blot) |
| 2.1.7 结果观察与分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 胸髓半横断后腰髓损伤侧FG标记的运动神经元数目变化 |
| 2.2.2 胸髓半横断后腰髓损伤侧FG标记的运动神经元和CB/CR-ir神经元周围的SYN表达变化 |
| 2.2.3 胸髓半横断后腰髓SYN蛋白表达变化 |
| 2.2.4 胸髓半横断后后肢运动功能检测BBB评分与腰髓SYN蛋白表达以及损伤侧CB-ir神经元、CR-ir神经元和FG标记的运动神经元周围的SYN-ir的相关性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 胸髓半横断后腰髓损伤侧运动神经元和中间神经元的突触可塑性变化 |
| 2.3.2 胸髓半横断后后肢运动功能恢复与腰髓的突触可塑性改变的关系 |
| 第三部分 大鼠胸髓半横断后腰髓可塑性变化的可能机制 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 动物模型制备和实验分组 |
| 3.1.2 BDA皮质脊髓束顺行示踪 |
| 3.1.3 BDA颈膨大长脊髓固有束神经元顺行示踪 |
| 3.1.4 组织制备 |
| 3.1.5 颈髓和腰髓BDA显色与CR/PV/SYN免疫荧光双标 |
| 3.1.6 结果观察与分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 颈髓后索BDA标记的CST轴突分布变化 |
| 3.2.2 颈髓BDA标记的CST侧枝及其与CR-ir和PV-ir神经元联系的变化 |
| 3.2.3 腰髓前角损伤侧BDA标记LPN轴突与SYN双标 |
| 3.2.4 腰髓前角损伤侧中BDA标记的LPN轴突与CR/PV-ir神经元联系的变化 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
（10）干细胞源性胆碱能样细胞对全横断损伤脊髓修复的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文 |
| 前言 |
| 材科和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
四、嗅神经鞘细胞移植修复成鼠半横断胸髓损伤（论文参考文献）
- [1]仿生静电纺水凝胶纤维束支架用于脊髓损伤修复的研究[D]. 陈春茂. 苏州大学, 2019(04)
- [2]NSCs与PLGA复合体移植对大鼠脊髓半横断损伤的修复作用[D]. 周权明. 石河子大学, 2016(02)
- [3]牛膝多肽对单侧坐骨神经横断诱导的脊髓和背根神经节细胞凋亡的影响[D]. 鞠前前. 南通大学, 2016(11)
- [4]神经干细胞和嗅粘膜嗅鞘细胞共培养及移植治疗切割海马伞大鼠的研究[D]. 黄镇. 苏州大学, 2012(10)
- [5]细胞移植治疗脊髓损伤的优化方案及PDGF-B在脊髓修复中的作用[D]. 刘佳. 昆明医学院, 2010(08)
- [6]NSC和OEC联合移植对SCT大鼠大脑皮质运动区神经元的作用及相关机制研究[D]. 李云. 昆明医学院, 2010(08)
- [7]嗅鞘细胞静脉移植治疗脊髓损伤的实验研究[D]. 吕昕刚. 泰山医学院, 2010(03)
- [8]表达NgRs的活化巨噬细胞在大鼠脊髓损伤修复中的作用机制[D]. 尹国栋. 第二军医大学, 2009(10)
- [9]大鼠胸髓半横断后腰髓前角的突触可塑性研究[D]. 黄良. 中南大学, 2008(02)
- [10]干细胞源性胆碱能样细胞对全横断损伤脊髓修复的影响[D]. 张卫民. 昆明医学院, 2007(06)