一、多孔菌漆酶性质研究（论文文献综述）
徐圣东[1]（2021）在《白腐真菌Leiotrametes lactinea漆酶的分离纯化及其降解染料的研究》文中研究说明染料在生产与使用过程中会产生大量的废水,这些废水中含有大量结构复杂,难降解且具生物毒性的化合物,给水体和土壤生态环境带来了严重的污染。目前染料废水处理技术主要有物理吸附分离和化学氧化法,具成本高、操作难及易产生二次污染等缺点。漆酶作为一种含铜多酚氧化酶,在染料降解方面具有操作方便、不易产生二次污染和作用底物广等优点,具有重要的研究价值。本研究以Leiotrametes lactinea菌株（JZ-21）为试验材料,优化了其母种培养基和液体发酵产漆酶培养基及发酵条件;然后利用离子交换层析对漆酶进行了分离纯化,进一步研究了该酶的理化性质及其对染料的降解效果。通过以上试验,得出如下结论:1.经过优化得出,JZ-21的母种最佳培养条件为:木糖20 g/L,酵母浸膏4.57 g/L,最佳碳氮比为25:1,米糠5 g/L,Mg SO4·7H2O 1 g/L和KH2PO4 1 g/L,最佳培养温度为40℃;液体发酵产漆酶的最佳条件为:马铃薯200 g/L,葡萄糖20g/L,KH2PO4 3 g/L,Mg SO4·7H2O 1.5 g/L,木屑20 g/L,转速160 r/min,温度26℃,p H值为6,接种量为7片菌块。2.经过DEAE-Sepharose离子交换层析、Q-Sepharose离子交换层析、DEAE-Sephadex离子交换层析对漆酶进行了分离纯化,得到电泳纯的漆酶,分子量为68.5 k Da,漆酶纯化倍数为15.5倍,回收率为18.3%。3.对纯化漆酶进行酶学性质分析,该酶最适温度范围为40℃-60℃,在30℃时耐受性最好,在20℃-50℃可以保持漆酶活力稳定;最适p H值为2,在p H 5-6时耐受性最好;Hg2+和Al3+在三种浓度下对漆酶活力都有明显的抑制作用,Na+、Zn2+、Mn2+、Ca2+对漆酶有轻微抑制作用,且随着浓度升高抑制作用逐渐增强,Cu2+在三种浓度下对漆酶抑制作用接近,K+对漆酶活力影响不明显;1%的甲醇、乙醇对漆酶活力无影响,1%丙酮和异丙醇对漆酶活力有轻微抑制作用,在以上四种有机溶剂浓度为10%时,漆酶活力仍能保持在75%以上。4.漆酶对染料降解实验中发现漆酶可以降解多种染料,且在添加介体物质ABTS和丁香醛后活性黑、考马斯亮蓝等多种染料的降解率明显提高。其中活性蓝R、伊文思蓝、铬黑T、曲利苯蓝、结晶紫、孔雀石绿、考马斯亮蓝、碱性品红、溴酚蓝、溴百里酚蓝和活性艳蓝的降解率在80%以上,甲基橙降解率在60%以上;经过响应面法优化后活性红KD-8B和活性藏青的降解率分别提高了38%和15%。5.进一步对JZ-21漆酶降解孔雀石绿染料的降解产物进行了分析。孔雀石绿在漆酶的作用下先生成隐色孔雀石绿,之后隐色孔雀石绿分解为间香豆酸、4-二甲基氨基苯甲酸乙酯和对异丙基苯胺,其中4-二甲基氨基苯甲酸乙酯还可以进一步分解为N,N-二甲基苯胺。综上所述,本研究为Leiotrametes lactinea菌株漆酶的酶学性质研究及染料降解方面提供了依据,具有一定的研究价值。
吴怡[2]（2020）在《灵芝属漆酶高产菌株的筛选及其所产漆酶的纯化和性质分析》文中认为漆酶是一种性质优良的绿色催化剂,由于在分子氧的协助下可将酚类、芳胺类化合物等多种底物氧化,最终得到水及其终产物,符合当代环保工业要求,因而在纸浆漂白、环境治理、生物检测、有机合成等领域有着巨大的应用潜力。许多具有生物技术价值的漆酶来源于真菌,尤其是白腐真菌,而针对白腐真菌降解木质素的研究开展以来,漆酶就引起了广泛关注。“灵芝”作为一类传统药用真菌的统称,同时也是重要的白腐真菌,除了具有抗氧化、抑肿瘤、抑菌、抗炎、降血糖血脂、提高免疫力等药用价值,还拥有高效分泌漆酶的潜在特性,但目前缺乏对该属真菌产漆酶能力的综合分析。据此,本研究对51株灵芝属真菌菌株的产漆酶能力进行了系统性研究,同时筛选获得了1株高产漆酶菌株南方灵芝[Ganoderma australe（Fr.）Pat.]Dai 11646,对其所产漆酶Galacc进行了纯化和酶学性质分析,实现了对新资源的探索,为高产漆酶灵芝属菌株的选育和开发利用提供了可靠的理论依据,同时也为漆酶在工业化等领域的应用研究奠定了重要的理论基础。首先,基于ITS和n LSU序列通过分子生物学手段准确鉴定了51株灵芝属真菌菌株,分属于6个种:G.applanatum、G.australe、G.brownii、G.orbiforme、G.lingzhi和G.multiplicatum。利用愈创木酚平板法初筛和液体发酵复筛对其产漆酶活性进行了系统性研究,最终筛选获得1株高产漆酶菌株G.australe Dai 11646。对于愈创木酚平板法筛选,供试菌株的漆酶产生率为98.04%,具有较普遍的产漆酶特性;不同菌株产生变色圈的时间、大小和颜色深浅不尽相同,一般在4-5 h内产生变色圈,颜色由水红色逐渐变为红褐色,1 d后颜色基本稳定,自中心向外圈晕状变浅至淡褐色;在菌丝生长过程中,变色圈直径同步增长,大部分菌株在前10 d漆酶活性较高;结合变色圈大小、种名和菌丝生长状况,筛选出Dai 11646、Cui 7048、Cui 7247、Cui 9164和Cui 16779进行复筛。对于液体发酵复筛,菌株的漆酶活性随时间的变化均呈现升高-降低的趋势,大部分菌株在第7 d达到峰值,G.australe Dai 11646漆酶活性最高（0.809 U/m L）。其次,采用盐沉淀、离子交换层析和分子筛层析对G.australe Dai 11646所产漆酶Galacc进行了纯化,使其比活力由粗酶液时的0.926 U/mg上升到了22.214 U/mg,纯化倍数是原来的23.989倍,回收率达到了38.44%。期间经离子交换层析柱纯化、以0.1、0.3和0.7 mol/L Na Cl洗脱时分别出现了3个酶活峰,即Galacc-F、Galacc-S和Galacc-T,其中以Galacc-F比活力（4.274 U/mg）最高,是G.australe Dai 11646分泌的主要漆酶部分,收集该酶活峰值部分的酶液进行后续分子筛层析纯化。最后,对G.australe Dai 11646纯化漆酶Galacc-F进行了酶学性质分析。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）发现Galacc-F是一种分子量为48.0 k Da的单体蓝铜漆酶;在p H 5.0-8.0和温度10℃-60℃范围内,Galacc-F表现出优越的活性和稳定性,这在工业过程中具有很高的应用价值;Galacc-F拥有广泛的底物特异性,尤其对ABTS亲和力最高,此时Km值较低,为164.137μM,kcat/Km比值较高,为1.663 s-1μM-1;在众多添加物中,Cu2+和β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol,β-ME）对Galacc-F活性起到显着的激活作用,而乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）、焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate,DEP）、碘乙酸（iodoacetic acid,IAA）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF）和Hg2+的添加却强烈抑制酶活,证明Galacc-F属于一种金属蛋白酶,含有典型的组氨酸-半胱氨酸-丝氨酸（histidine-cysteine-serine,His-Cys-Ser）催化结构;此外,该酶对表面活性剂、氧化剂和盐也有较强的耐受力;最重要的是,Galacc-F是一种比其他需要氧化还原介质的漆酶更理想的高效染料脱色催化剂。
吴怡,马鸿飞,曹永佳,司静,崔宝凯[3]（2019）在《真菌漆酶的性质、生产、纯化及固定化研究进展》文中提出真菌漆酶是一种性质优良的多酚氧化酶,由于在分子氧的协助下可将酚类、芳胺类化合物等多种底物氧化,最终得到水及其终产物,符合当代环保工业要求,因而在纸浆漂白、环境治理、生物检测、有机合成等领域有着巨大的应用潜力。就漆酶的生物学性质、生产、纯化、固定化等研究进展和现状进行了介绍和总结,同时对其今后的发展方向进行了展望。
李欣[4]（2019）在《高寒草地土壤产漆酶真菌筛选及其生物功能的研究》文中指出漆酶与木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶共同构成木质素降解酶系,在土壤腐殖质和有机质的形成过程中具有重要作用。为了探索和发现高寒草地土壤耐低温产漆酶真菌资源,进一步认识漆酶对高寒草地土壤有机质转化的作用,本论文主要开展了高寒草地土壤产漆酶真菌筛选、优良菌株生物学特性、漆酶的酶学性质以及对土壤有机质的矿化作用等4个方面的研究。研究结果如下:1、采用底物显色法从高寒草地土壤中筛选了9株产漆酶真菌,采用ITS-rDNA方法进行分子鉴定,鉴定结果为菌株1.9为Uncultured fungus clone.、2.1a为Scytalidium、310b为Marasmius tricolor、2.1c为Saccharicola、2.3a为fungal sp、2.4d为Saccharicola、10a为Marasmiusrotalis、3.7c为Alternaria.、WB为Verticillium longisporum。除菌株3.7c以外,其余8株菌株在以愈创木酚、蒽酮、邻联甲苯胺、联苯胺为底物的选择性培养基上都能产生氧化带;漆酶酶活力测定结果表明,菌株310b产漆酶的酶活力为1.62IU,与其余8个菌株相比酶活力最高,且差异显着（P<0.05）。2、以产漆酶活力最高的菌株Marasmius tricolor310b为研究对象,在不同条件下（温度、碳源、氮源、pH以及盐浓度）测定了菌落生长直径,结果表明,供试菌株310b在30℃,pH值为4.8,不添加NaCl的条件下生长最快,且差异显着（P<0.05）;以不加碳源为对照,添加蔗糖和糊精2种碳源后,菌落生长最快（P<0.05）;赖氨酸和尿素两种氮源对菌株的生长具有明显的抑制作用（P<0.05）。3、在不同温度、初始pH、金属离子和非营养有机物条件下,测定了菌株Marasmius tricolor310b产漆酶的酶活力。结果表明:菌株310b产酶最适反应温度为35℃,在0-45℃可保持较高酶活力;最适反应pH为4.5,在4.0-7.0范围内保持较高酶活;与对照相比Fe2+、Fe3+对酶活力有抑制作用（P<0.05）;乙醇可以增加酶活力（P<0.05）,而已腈、H2O2、SDA、EDTA对酶活力有抑制作用（P<0.05）,其中H2O2的抑制作用最强,添加丙酮对酶活力没有影响。4、通过测定土壤CO2释放量、土壤有机碳矿化速率、土壤有机碳含量、土壤微生物生物量碳含量以及土壤微生物呼吸熵。结果表明:添加产漆酶真菌菌株310b菌悬液后,上述各指标值均高于对照组,且都呈现规律性变化,说明产漆酶真菌菌株310b产生的漆酶对土壤有机质的形成转化过程具有促进作用。
程国辉,安小亚,王旭,张波,李玉[5]（2018）在《菌核多孔菌培养特性及驯化栽培》文中研究说明为了充分开发利用菌核多孔菌Polyporus tuberaster资源,对采自吉林省露水河东升林场的野生菌核多孔菌进行分离纯化获取纯菌株作为实验材料,采用十字划线法研究固体培养条件下不同碳源、氮源、pH和温度对其菌丝生长的影响,从以上4个单因素实验中选出3个最优水平进行正交实验。结果表明,菌核多孔菌P.tuberaster的最适培养条件为:碳源糊精粉（20mg/mL）、氮源酵母浸粉（2mg/mL）、pH 5.0、温度25℃。在最适培养条件下采用试剂盒测定液体培养条件下菌株的产酶活力,结果表明,菌核多孔菌产漆酶能力较强,酶活力最高可达386.96U/L;木质素过氧化物酶活力仅为5.23U/L;未检测到锰过氧化物酶。出菇实验中,二级种选用麦粒菌种,500mL罐头瓶装干料160g,每瓶接种蚕豆大小菌块3–4块,25℃培养,菌丝满瓶时间为20d;栽培种配方为阔叶树木屑78%、麦麸20%、石灰粉1%、石膏1%、含水量65%左右,17cm×33cm×0.05cm栽培袋装干料520g,每袋接种蚕豆大小二级种3–4块,菌丝发菌时间为26d;在92%–95%空气湿度、一定散射光和20–21℃低温刺激下培养13d后原基分化形成菇蕾,此后加大空气湿度至97%–98%并保持温度24–25℃培养32d后子实体成熟。
胡渤洋[6]（2018）在《毛栓菌漆酶分离纯化、介体系统及污染降解应用》文中认为漆酶（Laccase,EC 1.10.3.2）是一种含有多个Cu2+的多酚氧化酶,其广泛存在于真菌、细菌、高等植物及昆虫中。漆酶可以催化芳香类等物质的降解,如木质素、染料和农药等。由于一些环境化合物的氧化还原电势高于漆酶,因此限制了漆酶的降解应用。介体的发现使漆酶的作用范围扩大、降解速率提高,漆酶/介体系统（LMS）可以降解非酚类及氧化还原电势高的化合物,因此,漆酶在木质素降解和环境污染物的降解等方面有着潜在的应用价值。本文以实验室野外采集的26种真菌菌株为材料,筛选获得具有高效耐受农药的菌株（BUA-01）,并以BUA-01为实验出发菌株,研究其菌株培养及产酶条件、胞外漆酶分离纯化、酶学特性和基因克隆以及LMS对污染物的降解应用研究。具体内容如下:1、以吡虫啉（0.5%）、乙酰甲胺磷（0.2%）、草甘膦异丙胺盐（0.4%）和高效氯氰菊酯（2.2%）为作用靶标,对26种真菌开展农药高耐受菌筛选,得到BUA-01菌株,其在上述四种农药培养基中的生长速率分别是6.75±0.25 mm/d、5.25±0.00 mm/d、3.25±0.13 mm/d和4.67±0.26 mm/d。结合形态学特征观察及ITS分子鉴定,确定此菌株为毛栓菌（Trametes hirsuta）;BUA-01最适培养条件:淀粉为最适碳源,黄豆粉和酵母浸粉为最适氮源,最适C/N比为40/1和10/1,最适温度为37℃,最适pH为6.0-7.0,供试生长因子对菌丝生长无显着促进作用;培养基中Cu2+浓度为0.25 mmol/L,在培养96 h时,发酵液的漆酶活性达到最高,是对照组的26倍,为1081.33±6.3U/mL;BUA-01菌株发酵液对偶氮染料降解效果显着,12 h对依文思蓝、甲基橙和铬黑T的脱色率分别为93.31±0.16%、92.37±0.42%和79.25±0.64%。2、以5%的接种量将BUA-01菌株接种到终浓度为0.25 mM Cu2+的发酵培养基中,28℃、180rpm振荡培养3 d后,获得粗酶液。依次通过DEAE-Sepharose、SP-Sepharose和Q-Sepharose离子交换层析技术,获得电泳纯级的漆酶（THL）,经SDS-PAGE,确定其分子量为67.7 kDa;以ABTS为作用底物时,漆酶的最适温度为60℃;最适pH为2.2;在温度和pH分别在50-65℃和4.2条件下稳定性较高;Km与Vmax分别为28.44μM和555.56μmol/min;10.0 mM Mg2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+、Cd2+、Co2+和EDTA对漆酶有显着的抑制作用,抑制率25%-58%;而1.25 mM的Na+对漆酶具有微弱激活作用,酶活提高10%左右;1.25-10.0 mM K+对漆酶的活性无显着影响。通过以简并引物对漆酶保守序列进行扩增,获得长度为1226 bp的漆酶核心区cDNA部分序列,与T.hirsuta（KU878364.1）的相似性为97%,遗传距离为0.072。3、LMS研究表明,该漆酶的最适介体为乙酰丁香酮（AS）和四甲基哌啶氮氧化物（TEM）;LMS对碱性品红、甲基橙、孔雀石绿和依文思蓝降解效果最佳,24 h的降解率最高分别为72.3%、86.1%、88.2%和89.2%;全波段扫描结果表明,介体AS比介体TEM更具有提高漆酶反应速率的能力,且THL-AS和THL-TEM在降解碱性品红、甲基橙和依文思蓝染料过程中均有新物质生成;pH、温度和介体浓度对LMS的影响表明,THL-AS在pH 2.0-5.0,20-60℃,介体浓度为0.1 mM的条件下非常稳定,在1 h可实现对染料的高效降解,降解率可达80%左右;THL-TEM在pH 3.0-4.0,50-60℃,介体浓度为0.5-1.0 mM的条件下较为稳定,但降解效率不如THL-AS高;在24 h时,THL-TEM对乙酰甲胺磷的降解效果最好,为65.56%;THL-ABTS对黄曲霉毒素B1的降解效果最好,为20.88%;LMS反应液的10倍和50倍稀释液对黑麦草具有低植物毒性,且随着稀释倍数的增加,对根长生长的影响越小。
李佳谣[7]（2018）在《白腐真菌处理秸秆纤维素乙醇废水的试验研究》文中认为近年来利用农作物秸秆作为可再生资源制备燃料乙醇备受关注。以农作物、玉米秸秆等木质纤维素生物质为原料生产燃料乙醇虽然给社会和经济带来良好的效益,但是生产过程中产生大量高浓度有机废水,其中COD、悬浮物和木质素含量与色度均较高,另外含有大量的氨、磷酸盐等无机盐类。虽然目前已通过厌氧好氧等工艺来降低和部分去除此类废水中大部分有机物,但是出水仍然存在色度高、木质素浓度高等问题,对环境危害极大。由于木质素结构复杂,是目前公认的难降解污染物,在实际工程中木质素难降解,而白腐真菌是自然界中的木质素降解菌。因此,本试验开展了白腐真菌处理玉米秸秆纤维素乙醇废水的试验研究。对两种白腐真菌的生长和产酶关系进行研究,然后利用白腐真菌对不同稀释比例的废水进行降解,选出降解木质素效果好的菌种。在此基础上,进一步对白腐真菌降解秸秆纤维素乙醇废水条件优化进行研究,考察不同废水投加时间以及不同培养方式对玉米秸秆纤维素乙醇废水的处理效果的影响。最后,考察非灭菌环境下白腐真菌对玉米秸秆纤维素乙醇废水的降解情况。研究结果表明:根据两种白腐真菌对不同稀释比例的废水进行木质素降解情况,选择降解废水效果相对效果较好的菌种——青顶拟多孔菌。不同废水投加时间对青顶拟多孔菌处理稀释20%废水体系中木质素的降解效果影响较大,第5天投加废水可获得理想的木质素降解效果,降解率达到68.4%;不同投加废水时间的情况下,经青顶拟多孔菌处理后的各体系中BOD5/COD均有所提升,并且都提升至0.58以上,其中第9天投加废水体系经处理后BOD5/COD最大,达到0.64。不同培养方式对玉米秸秆纤维素乙醇废水的降解效果的影响较大,与悬浮培养相比,聚氨酯泡沫载体固定化培养技术可以使系统的木质素降解速度和降解效果以及COD去除率均优于悬浮培养。聚氨酯泡沫固定化培养方式不仅提高木质素降解率,而且缩短木质素降解周期。在非灭菌环境下,青顶拟多孔菌对废水中木质素降解效果基本未受到非灭菌环境的影响,与灭菌环境体系的木质素降解效果相差不大。悬浮培养条件下,灭菌与非灭菌环境下的木质素降解率分别为23.7%、20.2%;聚氨酯泡沫载体培养条件下,灭菌与非灭菌环境体系中木质素的降解率分别为27.0%、25.7%。反应器运行试验中,青顶拟多孔菌对废水中木质素降解和COD去除有一定的效果,降解了体系中31.3%的木质素,且COD去除率在第20天达到69.8%。添加诱导物为0.5 μmol/L的金属铜离子的反应体系提高了对木质素的降解率和COD去除率,木质素降解率在试验进行的第16天木质素降解率高达到59.1%,提高29.5%,COD去除率达到79.9%,提高10.1%。
刘丽荣[8]（2018）在《处理秸秆纤维素乙醇废水的东北土着白腐真菌筛选优化研究》文中指出为了提高秸秆纤维素乙醇废水的处理效果,选择6种东北土着白腐真菌,对2%的秸秆纤维素乙醇废水中木质素进行降解处理。采用正交试验法对筛选出的高效降解菌进行产漆酶培养基的优化。测定6种白腐真菌的产漆酶情况,其中血红密孔菌在第10天达到酶活高峰,漆酶活力为116.43 U/mL。青顶拟多孔菌在第16天达到酶活高峰,其漆酶活力为120.89 U/mL。糙皮侧耳菌在第8天达到酶活高峰,其漆酶活力为63.52 U/mL。彩绒革盖菌、烟色烟管菌和灵芝酶活较低,分别在第20天、第12天和第18天达到酶活高峰,其漆酶活力分别为3.78、2.47、1.66 U/mL。6种白腐真菌最高酶活大小顺序为:青顶拟多孔菌>血红密孔菌>糙皮侧耳菌>彩绒革盖菌>烟色烟管菌>灵芝;测定6种白腐真菌降解纤维素乙醇废水中的木质素,其中血红密孔菌、糙皮侧耳菌、彩绒革盖菌、青顶拟多孔菌、灵芝、烟色烟管菌在第0天起始浓度为640.9～716.6 mg/L,在第14天木质素的浓度分别为434.0、411.2、441.8、441.7、533.3、503.5 mg/L,对木质素的去除率分别为37.1%、37%、31.8%、31.7%、25.6%、21.4%。并分别在第12、12、4、4、2、6天木质素降解趋于平稳。表明降解效果最好的菌种为血红密孔菌。采用正交试验对血红密孔菌产漆酶培养基进行优化,血红密孔菌产漆酶培养基:最佳碳源为锯末,质量浓度为35 g/L。最佳氮源为蛋白胨,质量浓度为4 g/L。最佳pH为5。其中血红密孔菌更适应在偏弱酸的环境下生长,有机氮源比无机氮源更有利于菌种产漆酶。极差分析表明,各因素对血红密孔菌产漆酶的影响顺序为:碳源>氮源>pH>氮源浓度>碳源浓度。最优培养基条件下对2%的秸秆纤维素乙醇废水中的木质素进行降解,从第0～12天,木质素含量从742 mg/L降至452 mg/L,降解率达39.1%。在第12～14天,青顶拟多孔菌对木质素的降解减慢,木质素降解率变化不明显。木质素降解率趋于平稳,木质素的降解明显减少。在第14天降解率达41.1%。采用最优培养基对2%的纤维素乙醇废水中的COD进行降解,在第0～4天COD的初始降解速度较快,第4天木质素降解率达到45.3%。随着降解时间的增加,在第4～8天血红密孔菌对COD的降解减慢,COD降解率变化不明显。COD的去除效果没有显着提高,去除率始终维持在46.9%～47.6%之间。在第8天时获得了最大的COD去除效果,COD由1928.8 mg/L降至1010.8 mg/L,去除率达47.6%。结果表明血红密孔菌可以降解秸秆纤维素乙醇废水中的COD,但其降解效果不太理想,平均效率约为50%。测定白腐菌降解2%纤维素乙醇废水pH情况,白腐真菌培养初期pH值为4.9～5.9。随着培养时间的延长,pH值呈增加的趋势,在第18天投加废水的pH达8.25,未投加废水的pH达7.9,pH总体呈上升趋势。分析对比投加废水的pH和未投加废水的pH变化情况,在第9天加入秸秆纤维素乙醇废水时pH降低,因为秸秆纤维素乙醇废水呈酸性,所以在加入废水后使得pH下降。之后pH值缓慢上升,本研究为生物法处理秸秆纤维素乙醇废水提供了菌种资源,也为今后的进一步应用研究提供科学依据。
王寿南[9]（2017）在《野生多孔菌分离、鉴定与漆酶的分离纯化和基因克隆》文中研究指明多孔菌是指子实层体呈孔状、质地为革质至木质的一类大型担子菌,主要生长在各类木材上。部分多孔菌具有产酶活性、药用活性、降解活性等应用价值。开展多孔菌的采集、分离与功能活性研究,可为多孔菌资源的开发利用,奠定理论和实验基础。本文针对采集的野生多孔菌,开展分离鉴定、培养条件、抗氧化活性、胞外漆酶活性、农药降解作用研究。具体内容如下:1.对两株野生多孔菌子实体进行分离纯化获得纯培养SS菌株和BJ菌株,并对其分类学地位、最适培养条件和液体发酵产物抗氧化活性进行分析。结果表明:结合形态学特征和ITS鉴定,确定SS菌株为多瘤木层孔菌（Phellinus tuberculosus）。菌丝体最适培养条件研究表明,最适碳源为葡萄糖,最适氮源为黄豆粉,最适C/N比为20/1,最适生长因子为维生素C,最适温度为28℃,最适pH为7.0。发酵液抗氧化活性为0.102 mM（FeSO4）;BJ菌株为石榴嗜蓝孢孔菌（Fomitiporia punicata）。菌丝体最适培养碳源为葡萄糖和麦芽糖,最适氮源为酵母浸粉,最适C/N比为10/1,最适温度为28℃,最适pH为7.0。发酵液总抗氧化活性为0.517 mmol/L（维生素E）,菌体的总超氧化物歧化酶活力为770.37 U/g。2.分离获得一株高产漆酶活性的菌株,编号F1635,经过形态学和分子学鉴定为硬毛栓菌（Trametes trogii）,利用DEAE-Sepharose、SP-Sepharose和凝胶过滤层析等手段,对发酵液漆酶进行纯化,最终得到电泳纯级的酶蛋白（TsL）。进一步开展酶学特性、降解作用、基因克隆的研究。结果表明:该漆酶是分子量为64.8 kDa的单亚基蛋白。当以ABTS为作用底物时,Tsl的最适pH为2.6,最适温度为50℃,酶促动力学常数Km和Vmax值分别为18.58μM和1.125μmol/min。TsL漆酶对溴百里酚蓝、甲基橙、铬黑T、伊文思蓝等染料具有较强的降解作用,在12 h内降解率均达到78%以上;对农药乙酰甲胺磷和高效氯氰菊酯无明显降解作用。利用简并引物对漆酶的保守区进行克隆,得到长度分别为1246 bp和1264 bp的两条漆酶部分基因的cDNA序列。
郑飞[10]（2017）在《东方栓孔菌漆酶的纯化及对环境激素的降解》文中认为环境激素（EDCs）是一种外源性有毒化合物,释放到环境中会对人类及动物的健康和繁衍造成严重危害。近年来,漆酶作为一种绿色化学技术,可降解包括环境激素在内的多种芳香族化合物,引起了诸多科学家和工业的极大兴趣。本研究主要探究了白腐真菌东方栓孔菌Trametes orientalis漆酶Tolacc的纯化、固定化,并将其应用到环境激素类化合物邻苯二甲酸丁苄酯（BBP）、双酚A（BPA）、4-壬基苯酚（4-NP）和4-辛基苯酚（4-OP）的降解中。主要研究工作如下:首先,采用液体培养的方法分析东方栓孔菌在产漆酶过程中生理学指标的变化,即对菌丝体生物量、漆酶活性、还原糖含量、多酚含量、丙二醛（MDA）含量、总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性、过氧化氢（H202）水平、抗坏血酸（AA）含量、抑制羟自由基能力（RAHFR）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力等12项指标进行了测定。结果表明,漆酶能够直接影响白腐真菌对于营养物质的利用情况,其活性大小与菌株的生长状况及次级代谢密切相关;且漆酶活性与多酚含量、MDA含量、CAT活性和AA含量呈正相关,与H202水平和RAHFR呈负相关。对比了两种培养基Ⅰ（富营养）和Ⅱ（缺营养）条件下测得的生理学指标,发现在液体培养基Ⅱ中东方栓孔菌具有较高的菌丝体生物量、SOD活性、RAHFR和DPPH自由基清除能力及较低的H202水平,说明液体培养基Ⅱ的缺营养条件可以在一定程度上激发菌株的抗氧化能力以保护机体免受氧化损伤。其次,通过硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱层析（DEAE-cellulose DE52）和琼脂糖凝胶柱层析（Sepharose CL-6B）三步纯化的方法得到了漆酶Tolacc,其比活力达20.667 U/mg,是纯化前粗酶液的20.282倍,回收率为47.33%。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）显示Tolacc呈现单一条带,是一类单体蛋白,分子量为44.0 kDa。Tolacc的最适pH和温度分别为4.0和800C,且在10℃-50℃下处理2 h后仍能保持初始酶活的80%以上。该酶对2,2’-连氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）表现出严格的底物专一性,而对其他底物并未检测到活性。在多种金属离子中,Mn2+可作为提高Tolacc活性的激活剂。金属螯合剂叠氮化钠（NaN3）、半胱氨酸和二硫苏糖醇（DTT）可显着抑制Tolacc活性,而乙二胺四乙酸（EDTA）的添加对其酶活的抑制作用却较低。此外,对于不同结构的染料,纯化的酶蛋白在未添加介体条件下具有较好的脱色效果。此外,为提高上述纯化漆酶Tolacc的稳定性及回收率,采用载体壳聚糖、交联剂戊二醛对Tolacc进行固定化处理,发现其固定化的最佳工艺条件为0.6%（v/v）交联剂戊二醛浓度、3 h交联时间、3.0 mL给酶量、6 h固定时间。相较于游离漆酶,经过固定化处理后的漆酶pH和温度的适应能力均有所增强。稳定性上,比游离漆酶更显优势,且具有良好的连续使用稳定性,被循环使用5次后,活性仍保持45%以上。通过傅里叶红外光谱（FT-IR）分析和气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析得到固定化漆酶Tolacc对环境激素类化合物均有一定程度的降解作用。通过本研究,得到了性质优良稳定的酶蛋白,为漆酶在更多领域的应用提供了可靠的理论指导,并为环境激素类化合物的无污染化处理奠定基础,同时也为白腐真菌新资源的开发利用提供技术手段。
二、多孔菌漆酶性质研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、多孔菌漆酶性质研究（论文提纲范文）
（1）白腐真菌Leiotrametes lactinea漆酶的分离纯化及其降解染料的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.引言 |
| 1.1 漆酶简介 |
| 1.2 漆酶理化性质 |
| 1.2.1 温度 |
| 1.2.2 pH |
| 1.2.3 金属离子及抑制剂耐受性 |
| 1.3 漆酶的诱导 |
| 1.4 漆酶的异源表达 |
| 1.5 固定化漆酶 |
| 1.6 漆酶介体 |
| 1.7 漆酶应用 |
| 1.7.1 降解染料 |
| 1.7.2 降解农药 |
| 1.7.3 食品行业 |
| 1.7.4 纺织行业 |
| 1.7.5 生物能源 |
| 1.7.6 生物检测 |
| 1.7.7 化工行业 |
| 1.7.8 造纸行业 |
| 1.7.9 其它应用 |
| 1.8 白腐真菌概述 |
| 1.9 研究目的与意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 培养基及溶剂配置 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 漆酶酶活测定 |
| 2.2.2 产漆酶菌株筛选 |
| 2.2.3 母种培养基优化 |
| 2.2.4 液体发酵产漆酶培养基优化 |
| 2.2.5 漆酶的分离纯化、鉴定和酶学性质分析 |
| 2.2.6 漆酶对染料的降解实验 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 菌种筛选 |
| 3.2 母种培养基优化 |
| 3.2.1 碳源筛选 |
| 3.2.2 氮源筛选 |
| 3.2.3 碳氮比筛选 |
| 3.2.4 无机盐筛选 |
| 3.2.5 添加物筛选 |
| 3.2.6 正交实验优化 |
| 3.2.7 培养温度筛选 |
| 3.3 液体发酵产漆酶培养基优化 |
| 3.3.1 液体基础培养基筛选 |
| 3.3.2 产酶诱导物筛选 |
| 3.3.3 产酶转速筛选 |
| 3.3.4 产酶温度筛选 |
| 3.3.5 产酶p H值筛选 |
| 3.3.6 产酶接种量筛选 |
| 3.4 漆酶的分离纯化、鉴定和酶学性质分析 |
| 3.4.1 DEAE-Sepharose离子交换层析 |
| 3.4.2 Q-Sepharose离子交换层析 |
| 3.4.3 DEAE-Sephadex离子交换层析 |
| 3.4.4 SDS-PAGE检测 |
| 3.4.5 漆酶的分子量测定 |
| 3.4.6 漆酶酶学特性分析 |
| 3.5 漆酶对染料的降解实验结果 |
| 3.5.1 粗酶液与L1 组分中木质素酶系活性 |
| 3.5.2 粗酶液对染料的降解效果 |
| 3.5.3 初提纯漆酶对染料的降解效果 |
| 3.5.4 纯漆酶降解孔雀石绿染料产物分析 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间论文发表情况 |
（2）灵芝属漆酶高产菌株的筛选及其所产漆酶的纯化和性质分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 1 绪论 |
| 1.1 漆酶的研究进展 |
| 1.1.1 漆酶的定义 |
| 1.1.2 漆酶的来源 |
| 1.1.3 漆酶的结构 |
| 1.1.4 漆酶的催化作用 |
| 1.1.5 漆酶的理化性质 |
| 1.2 真菌漆酶的生产 |
| 1.2.1 漆酶高产菌株的筛选 |
| 1.2.2 生产漆酶的培养条件 |
| 1.2.3 漆酶的诱导生产 |
| 1.3 真菌漆酶的纯化 |
| 1.3.1 漆酶纯化的意义 |
| 1.3.2 酶纯化的原则 |
| 1.3.3 漆酶纯化的方法 |
| 1.4 染料废水的处理技术 |
| 1.4.1 染料废水的特点 |
| 1.4.2 染料废水的处理方法 |
| 1.4.3 漆酶在处理染料废水中的应用 |
| 1.5 白腐真菌灵芝属的概况 |
| 1.5.1 灵芝属真菌的分类学现状 |
| 1.5.2 灵芝属真菌的鉴定 |
| 1.5.3 灵芝属真菌的生物学特性 |
| 1.6 选题的目的、意义和研究内容 |
| 2 灵芝属真菌菌株的鉴定和漆酶高产菌株的确定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 供试培养基 |
| 2.1.3 所用试剂 |
| 2.1.4 仪器和耗材 |
| 2.1.5 溶液的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 菌株的活化 |
| 2.2.2 DNA的提取 |
| 2.2.3 PCR扩增 |
| 2.2.4 系统发育树的构建 |
| 2.2.5 愈创木酚平板法初筛 |
| 2.2.6 菌悬液的制备 |
| 2.2.7 粗酶液的制备 |
| 2.2.8 漆酶活性的测定 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 菌株的鉴定 |
| 2.3.2 愈创木酚平板法初筛 |
| 2.3.3 液体发酵复筛 |
| 3 筛选获得菌株南方灵芝所产漆酶Galacc的纯化 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 供试菌株 |
| 3.1.2 供试培养基 |
| 3.1.3 所用试剂 |
| 3.1.4 仪器和耗材 |
| 3.1.5 溶液的配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 菌株的活化 |
| 3.2.2 菌悬液的制备 |
| 3.2.3 粗酶液的制备 |
| 3.2.4 漆酶活性的测定 |
| 3.2.5 蛋白质含量的测定 |
| 3.2.6 漆酶Galacc的分离纯化 |
| 3.2.7 纯化倍数及回收率计算 |
| 3.2.8 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 盐沉淀分离漆酶Galacc |
| 3.3.2 离子交换层析纯化漆酶Galacc |
| 3.3.3 南方灵芝漆酶Galacc的纯化结果 |
| 4 南方灵芝纯化漆酶Galacc-F的酶学性质分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 供试菌株 |
| 4.1.2 供试培养基 |
| 4.1.3 所用试剂 |
| 4.1.4 仪器和耗材 |
| 4.1.5 溶液的配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 菌株的活化 |
| 4.2.2 种子发酵 |
| 4.2.3 漆酶活性的测定 |
| 4.2.4 漆酶Galacc-F的纯化 |
| 4.2.5 纯化漆酶Galacc-F的酶学性质分析 |
| 4.2.6 统计学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 漆酶Galacc-F的分子量 |
| 4.3.2 漆酶Galacc-F的光谱性质 |
| 4.3.3 纯化漆酶Galacc-F的贮存稳定性 |
| 4.3.4 pH对纯化漆酶Galacc-F活性和稳定性的影响 |
| 4.3.5 温度对纯化漆酶Galacc-F活性和稳定性的影响 |
| 4.3.6 漆酶Galacc-F的底物特异性及动力学常数 |
| 4.3.7 金属离子和改性剂对纯化漆酶Galacc-F活性的影响 |
| 4.3.8 纯化漆酶Galacc-F的耐盐能力 |
| 4.3.9 纯化漆酶Galacc-F对染料的脱色 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 本论文的创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介1 |
| 导师简介2 |
| 获得成果目录清单 |
| 致谢 |
（3）真菌漆酶的性质、生产、纯化及固定化研究进展（论文提纲范文）
| 1 真菌漆酶的生物学性质 |
| 1.1 结构特征 |
| 1.2 催化作用 |
| 1.3 理化性质 |
| 1.3.1 温度 |
| 1.3.2 pH |
| 1.3.3 金属离子 |
| 2 真菌漆酶的生产 |
| 2.1 漆酶高产菌株的筛选 |
| 2.2 培养条件 |
| 2.3 漆酶的诱导生产 |
| 3 真菌漆酶的纯化 |
| 4 真菌漆酶的固定化 |
| 5 小结 |
（4）高寒草地土壤产漆酶真菌筛选及其生物功能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写词 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 漆酶概述 |
| 1.2 漆酶来源 |
| 1.3 漆酶的功能及应用 |
| 1.3.1 漆酶在生物体中的功能 |
| 1.3.2 漆酶在食品领域的应用 |
| 1.3.3 漆酶在动物营养方面的应用 |
| 1.3.4 漆酶在工业污染物处理及生物修复方面的应用 |
| 1.3.5 漆酶在生物质利用方面的应用 |
| 1.3.6 漆酶在土壤腐殖质形成过程中的应用 |
| 1.3.7 漆酶在生态系统物质循环方面的应用 |
| 1.4 漆酶的研究方法 |
| 1.5 高寒草地产漆酶真菌研究现状 |
| 1.6 本文的研究意义和研究内容 |
| 1.6.1 研究意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 研究路线 |
| 第2章 高寒草地产漆酶真菌的筛选及分子鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 培养基及其配制 |
| 2.1.5 实验设计 |
| 2.1.6 研究方法 |
| 2.1.7 数据处理及分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 产漆酶菌株的DNA-ITS分子鉴定结果 |
| 2.2.2 供试菌株在不同底物选择性培养基上的显色情况 |
| 2.2.3 供试菌株在底物选择性培养基上出现氧化带的时序 |
| 2.2.4 供试菌株在底物选择性培养基上的生长情况及氧化带大小 |
| 2.2.5 产漆酶菌株310b产生漆酶活力 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第3章 菌株Marasmius tricolor310b的生物学特性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试菌株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 培养基及其配制 |
| 3.1.5 实验设计 |
| 3.1.6 研究方法 |
| 3.1.7 数据处理及分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同NaCl浓度对菌株310b菌落生长的影响 |
| 3.2.2 不同pH对菌株310b菌落生长的影响 |
| 3.2.3 温度对菌株310b菌落生长的影响 |
| 3.2.4 不同碳源对菌株310b菌落生长的影响 |
| 3.2.5 不同氮源对菌株310b菌落生长的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 菌株Marasmius tricolor310b产漆酶酶学性质的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试菌株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 培养基及其配制 |
| 4.1.5 实验设计 |
| 4.1.6 研究方法 |
| 4.1.7 数据处理及分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 最适温度和对温度的稳定性 |
| 4.2.2 最适pH和对pH的稳定性 |
| 4.2.3 不同离子对漆酶活力的影响 |
| 4.2.4 非营养有机物对漆酶活力的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第5章 菌株Marasmius tricolor 310b对土壤有机质矿化作用的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试菌株、土壤样品及植物样品 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要试剂的配制 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 培养基及其配制 |
| 5.1.6 实验设计 |
| 5.1.7 研究方法 |
| 5.1.8 数据处理及分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 碳矿化速率 |
| 5.2.2 土壤有机碳含量 |
| 5.2.3 微生物量碳含量 |
| 5.2.4 微生物呼吸熵 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 全文总结 |
| 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）菌核多孔菌培养特性及驯化栽培（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 供试菌株: |
| 1.1.2 供试固体培养基: |
| 1.1.3 供试液体发酵培养基: |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 菌种活化: |
| 1.2.2 碳源优化实验: |
| 1.2.3 氮源优化实验: |
| 1.2.4 p H优化实验: |
| 1.2.5 温度优化实验: |
| 1.2.6 正交实验: |
| 1.2.7 液体发酵培养及酶活力测定: |
| 1.2.8 驯化栽培: |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同碳源对菌核多孔菌菌丝生长的影响 |
| 2.2 不同氮源对菌核多孔菌菌丝生长的影响 |
| 2.3 不同p H对菌核多孔菌菌丝生长的影响 |
| 2.4 不同温度对菌核多孔菌菌丝生长的影响 |
| 2.5 正交实验 |
| 2.6 液体发酵及酶活力测定 |
| 2.7 驯化栽培 |
| 2.7.1 二级种制作: |
| 2.7.2栽培种制作: |
| 2.7.3 催蕾与出菇: |
| 3 讨论 |
（6）毛栓菌漆酶分离纯化、介体系统及污染降解应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 漆酶研究进展 |
| 1.1.1 漆酶的分类与功能 |
| 1.1.2 漆酶的结构及反应机理 |
| 1.1.3 漆酶的理化性质 |
| 1.1.4 漆酶分离纯化方法 |
| 1.1.5 漆酶基因克隆 |
| 1.2 漆酶介体系统 |
| 1.2.1 漆酶的氧化还原电势 |
| 1.2.2 常见的介体 |
| 1.2.3 漆酶介体系统的氧化机制 |
| 1.3 漆酶应用研究 |
| 1.3.1 染料降解应用 |
| 1.3.2 农药降解应用 |
| 1.3.3 木质素降解应用 |
| 1.3.4 其他领域应用 |
| 1.3.5 漆酶的固定化 |
| 1.4 栓菌属真菌漆酶研究 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 菌株筛选、鉴定、最适培养条件及其产酶特性研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株的采集与保藏 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 耐受农药菌株的筛选 |
| 2.4.2 BUA-01菌株的分子鉴定 |
| 2.4.3 BUA-01菌丝体最适培养条件研究 |
| 2.4.4 Cu~(2+)对液体发酵漆酶产量的影响 |
| 2.4.5 BUA-01菌株对偶氮染料的降解作用 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 菌株的筛选 |
| 2.5.2 形态学观察 |
| 2.5.3 基于ITS序列的系统发育分析 |
| 2.5.4 BUA-01菌丝体最适培养条件研究 |
| 2.5.5 Cu~(2+)对BUA-01发酵液产漆酶量的影响 |
| 2.5.6 BUA-01对偶氮染料的降解研究 |
| 2.6 分析与讨论 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 BUA-01菌株胞外漆酶分离纯化、酶学特性和基因克隆 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 实验器材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 酶活测定 |
| 3.2.2 漆酶的分离纯化 |
| 3.2.3 SDS-PAGE电泳检测 |
| 3.2.4 漆酶肽段测序 |
| 3.2.5 漆酶N末端测序 |
| 3.2.6 漆酶酶学特性实验 |
| 3.2.7 RNA的提取及cDNA的合成 |
| 3.2.8 漆酶基因核心区的克隆 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 DEAE-Sepharose弱阴离子交换层析 |
| 3.3.2 SP-Sepharose强阳离子交换层析 |
| 3.3.3 Q-Sepharose强阴离子交换层析 |
| 3.3.4 漆酶分离纯化效率 |
| 3.3.5 SDS-PAGE电泳检测 |
| 3.3.6 漆酶肽段测序 |
| 3.3.7 漆酶N-末端测序 |
| 3.3.8 漆酶酶学特性实验 |
| 3.3.9 RNA提取及cDNA的合成 |
| 3.3.10 漆酶核心区域基因的克隆 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 漆酶/介体系统(LMS)对污染物的降解研究 |
| 4.1 实验材料与仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 LMS对常见染料的降解 |
| 4.2.2 温度对LMS降解染料的影响 |
| 4.2.3 pH对LMS降解染料的影响 |
| 4.2.4 不同介体浓度对LMS降解染料的影响 |
| 4.2.5 LMS对乙酰甲胺磷的降解 |
| 4.2.6 LMS对黄曲霉毒素B1的降解 |
| 4.2.7 LMS降解染料产物的植物毒性研究 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 LMS对染料的降解 |
| 4.3.2 温度对LMS降解染料影响 |
| 4.3.3 pH对LMS降解染料影响 |
| 4.3.4 不同浓度介体对LMS降解染料影响 |
| 4.3.5 LMS对乙酰甲胺磷的降解 |
| 4.3.6 LMS对黄曲霉毒素B1的降解 |
| 4.3.7 植物毒性检测 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 全文总结与进一步工作 |
| 5.1 全文结论 |
| 5.2 进一步工作 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 Ⅰ BUA-01菌株ITS部分序列 |
| 附录 Ⅱ THL漆酶N-末端测序谱图 |
| 附录 Ⅲ 乙酰甲胺磷HPLC谱图 |
| 附录 Ⅳ THL核心区部分cDNA序列 |
| 个人简介 |
（7）白腐真菌处理秸秆纤维素乙醇废水的试验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 课题背景 |
| 1.2 秸秆纤维素乙醇废水的来源及特点 |
| 1.2.1 废水来源 |
| 1.2.2 废水特点 |
| 1.3 秸秆乙醇生产废水处理技术研究现状 |
| 1.3.1 物化处理 |
| 1.3.2 生物处理 |
| 1.4 白腐真菌的概述及研究现状 |
| 1.4.1 白腐真菌的种类 |
| 1.4.2 漆酶及漆酶生产菌 |
| 1.4.3 白腐真菌降解多环芳烃化合物研究 |
| 1.4.4 白腐真菌降解木质素研究 |
| 1.4.5 白腐真菌固定化培养及降解技术研究 |
| 1.4.6 非灭菌环境下白腐真菌降解染料研究现状 |
| 1.5 本论文研究目的与意义及研究内容 |
| 1.5.1 研究的目的与意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 菌种培养基及培养条件 |
| 2.1.3 载体 |
| 2.1.4 试验仪器与药品 |
| 2.1.5 试验用水 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 培养试验 |
| 2.2.2 对不同稀释比的废水降解试验 |
| 2.2.3 废水投加时间的调控 |
| 2.2.4 不同培养方式的降解试验 |
| 2.2.5 非灭菌环境下降解废水 |
| 2.3 测定方法 |
| 2.3.1 COD和BOD测定 |
| 2.3.2 漆酶活性测定 |
| 2.3.3 木质素测定 |
| 2.3.4 生物量测定 |
| 3 不同白腐真菌降解秸秆纤维素乙醇废水效果的研究 |
| 3.1 白腐真菌生长与产酶特征 |
| 3.1.1 糙皮侧耳菌的生长与产酶关系 |
| 3.1.2 青顶拟多孔菌的生长与产酶关系 |
| 3.2 白腐真菌对不同稀释比例的废水降解木质素情况 |
| 3.2.1 糙皮侧耳菌降解废水中木质素情况 |
| 3.2.2 青顶拟多孔菌降解废水中木质素情况 |
| 3.3 本章小结 |
| 4 青顶拟多孔菌降解秸秆纤维素乙醇废水优化条件研究 |
| 4.1 不同投加时间对废水降解情况 |
| 4.1.1 对木质素去除 |
| 4.1.2 对废水可生化性影响 |
| 4.2 不同培养方式对废水降解情况 |
| 4.2.1 对木质素去除 |
| 4.2.2 对COD去除 |
| 4.3 本章小结 |
| 5 非灭菌环境下青顶拟多孔菌对秸秆纤维素乙醇废水降解情况 |
| 5.1 静态试验中废水降解效果情况 |
| 5.1.1 对木质素去除 |
| 5.1.2 对COD去除 |
| 5.2 反应器运行试验中废水降解情况 |
| 5.2.1 对木质素去除 |
| 5.2.2 对COD去除 |
| 5.3 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）处理秸秆纤维素乙醇废水的东北土着白腐真菌筛选优化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 课题背景 |
| 1.2 纤维素乙醇废水的来源与特点 |
| 1.2.1 纤维素乙醇废水的来源 |
| 1.2.2 纤维素乙醇废水的特点 |
| 1.3 纤维素乙醇废水国内外研究现状 |
| 1.3.1 农田灌溉 |
| 1.3.2 浓缩燃烧法 |
| 1.3.3 物化法 |
| 1.3.4 生物处理法 |
| 1.4 白腐真菌概述 |
| 1.4.1 白腐菌的分类 |
| 1.4.2 白腐菌的酶系统研究 |
| 1.4.3 漆酶的特性及应用 |
| 1.5 白腐菌在工业废水中的应用 |
| 1.5.1 处理染料废水 |
| 1.5.2 处理焦化废水 |
| 1.5.3 处理重金属废水 |
| 1.5.4 处理炸药废水 |
| 1.5.5 处理造纸废水 |
| 1.6 研究的目的意义及内容 |
| 1.6.1 研究的目的意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 实验仪器与设备 |
| 2.1.3 药品与试剂 |
| 2.1.4 试验废水 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌种的培养 |
| 2.2.2 白腐真菌对秸秆纤维素乙醇废水中木质素的降解试验 |
| 2.2.3 最优条件下血红密孔菌对废水的降解试验 |
| 2.2.4 正交实验 |
| 2.2.5 木质素的测定 |
| 2.2.6 漆酶的测定 |
| 2.2.7 正交试验分析方法 |
| 3 白腐真菌降解秸秆纤维素乙醇废水的菌种筛选 |
| 3.1 六种白腐真菌的生长情况 |
| 3.2 六种白腐真菌的产漆酶情况 |
| 3.3 六种白腐真菌降解秸秆纤维素乙醇废水中木质素的菌种筛选 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 血红密孔菌最佳产漆酶培养基的优化 |
| 4.1 正交试验方案 |
| 4.2 血红密孔菌培养基优化结果与分析 |
| 4.3 本章小结 |
| 5 血红密孔菌降解秸秆纤维素乙醇废水的应用研究 |
| 5.1 优化后血红密孔菌对秸秆纤维素乙醇废水中木质素的降解 |
| 5.2 优化后血红密孔菌对秸秆纤维素乙醇废水COD的降解情况 |
| 5.3 优化后血红密孔菌对秸秆纤维素乙醇废水的pH变化情况 |
| 5.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）野生多孔菌分离、鉴定与漆酶的分离纯化和基因克隆（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 多孔菌的简介 |
| 1.2 多孔菌的药用价值 |
| 1.2.1 抗肿瘤 |
| 1.2.2 抗氧化 |
| 1.2.3 降血糖 |
| 1.2.4 降血脂 |
| 1.2.5 其他活性 |
| 1.3 多孔菌的活性成分 |
| 1.3.1 多糖 |
| 1.3.2 凝集素 |
| 1.3.3 杂聚糖和糖肽 |
| 1.3.4 萜类 |
| 1.3.5 甾类、酚类、泛醌类等 |
| 1.4 真菌漆酶研究 |
| 1.4.1 漆酶的简介 |
| 1.4.2 漆酶的发现和来源 |
| 1.4.3 漆酶的生物学功能 |
| 1.4.4 漆酶的理化特征 |
| 1.4.5 漆酶的活力测定 |
| 1.4.6 漆酶的催化机制 |
| 1.4.7 漆酶的结构及晶体研究 |
| 1.4.8 漆酶基因的克隆与异源表达 |
| 1.4.9 漆酶的应用 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 两株多孔菌的分离鉴定、最适培养条件及抗氧化研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 菌株的分离、培养与保存 |
| 2.4.2 菌株的形态鉴定 |
| 2.4.3 菌丝总DNA的提取 |
| 2.4.4 ITS分类学鉴定 |
| 2.4.5 菌丝的最适培养条件 |
| 2.4.6 液体发酵培养与发酵产物的收集 |
| 2.4.7 发酵液抗氧化活性的测定 |
| 2.4.8 发酵液菌体中总超氧化物歧化酶和自由基清除能力的测定 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 形态鉴定 |
| 2.5.2 基于ITS序列的系统发育分析 |
| 2.5.3 菌丝的最适培养条件 |
| 2.5.4 发酵液生物学特性 |
| 2.6 分析与讨论 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 多孔菌漆酶的分离纯化及特性研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 试剂 |
| 3.2.2 主要实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 菌株分离与鉴定 |
| 3.3.2 漆酶活性的测定 |
| 3.3.3 发酵液漆酶的分离纯化 |
| 3.3.4 漆酶的SDS-PAGE纯度检测 |
| 3.3.5 漆酶序列的测定 |
| 3.3.6 漆酶酶学性质测定 |
| 3.3.7 漆酶对染料的降解作用 |
| 3.3.8 漆酶对农药的降解作用 |
| 3.3.9 漆酶基因的克隆 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 F1635菌株的分离鉴定 |
| 3.4.2 漆酶的分离纯化 |
| 3.4.3 漆酶的理化性质 |
| 3.4.4 漆酶对染料的降解 |
| 3.4.5 漆酶对农药的降解 |
| 3.4.6 漆酶基因的克隆 |
| 3.5 分析与讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 结论 |
| 4.1 结论 |
| 4.1.1 两株多孔菌的分离鉴定、最适培养条件及抗氧化研究 |
| 4.1.2 硬毛栓菌漆酶的分离纯化及特性研究 |
| 4.2 进一步的工作 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简介 |
（10）东方栓孔菌漆酶的纯化及对环境激素的降解（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1 绪论 |
| 1.1 环境激素的研究进展 |
| 1.1.1 环境激素的定义 |
| 1.1.2 环境激素的分类 |
| 1.1.3 环境激素的危害 |
| 1.2 邻苯二甲酸丁苄酯、双酚A、4-壬基苯酚和4-辛基苯酚的基本概况 |
| 1.2.1 邻苯二甲酸丁苄酯 |
| 1.2.2 双酚A |
| 1.2.3 4-壬基苯酚 |
| 1.2.4 4-辛基苯酚 |
| 1.3 环境激素的降解 |
| 1.3.1 光催化降解法 |
| 1.3.2 亲核取代-热分解法 |
| 1.3.3 活性炭纤维吸附处理 |
| 1.3.4 微生物降解法 |
| 1.4 白腐真菌简介 |
| 1.4.1 白腐真菌概念 |
| 1.4.2 白腐真菌的木质纤维素降解酶系 |
| 1.5 漆酶概述 |
| 1.5.1 漆酶的定义 |
| 1.5.2 漆酶的结构特征 |
| 1.5.3 漆酶的理化性质 |
| 1.5.4 漆酶的应用 |
| 1.6 漆酶的纯化 |
| 1.6.1 酶纯化的意义 |
| 1.6.2 纯化的方法 |
| 1.7 漆酶的固定化技术 |
| 1.7.1 固定化技术的发展历程 |
| 1.7.2 固定化处理的方法 |
| 1.7.3 固定化技术的应用 |
| 1.8 选题的目的、意义和研究内容 |
| 2 白腐真菌东方栓孔菌在两种液体培养基中产漆酶过程的生理学研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 供试菌株 |
| 2.2.2 供试培养基 |
| 2.2.3 试剂 |
| 2.2.4 仪器和耗材 |
| 2.2.5 溶液的配制 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 菌种活化 |
| 2.3.2 种子发酵 |
| 2.3.3 样品制备 |
| 2.3.4 东方栓孔菌在液体培养条件下产漆酶过程中生理学指标的测定 |
| 2.3.5 数据统计分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 液体培养基Ⅰ和Ⅱ中东方栓孔菌的菌丝体生物量比较 |
| 2.4.2 液体培养基Ⅰ和Ⅱ中东方栓孔菌的漆酶活性比较 |
| 2.4.3 液体培养基Ⅰ和Ⅱ中东方栓孔菌的还原糖含量比较 |
| 2.4.4 液体培养基Ⅰ和Ⅱ中东方栓孔菌的多酚含量比较 |
| 2.4.5 液体培养基Ⅰ和Ⅱ中东方栓孔菌的丙二醛含量比较 |
| 2.4.6 液体培养基Ⅰ和Ⅱ中东方栓孔菌的总抗氧化能力比较 |
| 2.4.7 液体培养基Ⅰ和Ⅱ中东方栓孔菌的超氧化物歧化酶活性比较 |
| 2.4.8 液体培养基Ⅰ和Ⅱ中东方栓孔菌的过氧化氢酶活性比较 |
| 2.4.9 液体培养基Ⅰ和Ⅱ中东方栓孔菌的过氧化氢水平比较 |
| 2.4.10 液体培养基Ⅰ和Ⅱ中东方栓孔菌的抗坏血酸含量比较 |
| 2.4.11 液体培养基Ⅰ和Ⅱ中东方栓孔菌的抑制羟自由基能力比较 |
| 2.4.12 液体培养基Ⅰ和Ⅱ中东方栓孔菌的DPPH自由基清除能力比较 |
| 2.5 小结 |
| 3 东方栓孔菌漆酶的纯化及其性质探索 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 供试菌株 |
| 3.2.2 供试培养基 |
| 3.2.3 试剂 |
| 3.2.4 仪器和耗材 |
| 3.2.5 溶液的配制 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 菌种活化 |
| 3.3.2 种子发酵 |
| 3.3.3 粗酶液制备 |
| 3.3.4 东方栓孔菌漆酶的纯化 |
| 3.3.5 漆酶活性和蛋白质含量的测定 |
| 3.3.6 纯化倍数和回收率的计算 |
| 3.3.7 东方栓孔菌纯化漆酶Tolacc的酶学性质分析 |
| 3.3.8 东方栓孔菌纯化漆酶Tolacc对染料的脱色作用 |
| 3.3.9 数据统计分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 东方栓孔菌漆酶的纯化 |
| 3.4.2 东方栓孔菌纯化漆酶Tolacc的酶学性质分析 |
| 3.4.3 东方栓孔菌纯化漆酶Tolacc对染料的脱色作用 |
| 3.5 小结 |
| 4 东方栓孔菌漆酶的固定化及其对环境激素的降解 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 供试菌株 |
| 4.2.2 供试培养基 |
| 4.2.3 试剂 |
| 4.2.4 仪器和耗材 |
| 4.2.5 溶液的配制 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 菌种活化 |
| 4.3.2 种子发酵 |
| 4.3.3 漆酶活性的测定 |
| 4.3.4 东方栓孔菌漆酶Tolacc的纯化 |
| 4.3.5 壳聚糖载体的制备 |
| 4.3.6 东方栓孔菌漆酶Tolacc的固定化 |
| 4.3.7 东方栓孔菌漆酶Tolacc固定化条件的优化 |
| 4.3.8 东方栓孔菌游离和固定化漆酶Tolacc的酶学性质比较 |
| 4.3.9 东方栓孔菌固定化漆酶Tolacc的连续使用性 |
| 4.3.10 游离漆酶和固定化漆酶Tolacc对环境激素类化合物的降解 |
| 4.3.11 数据统计分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 东方栓孔菌漆酶Tolacc固定化条件的优化 |
| 4.4.2 东方栓孔菌游离和固定化漆酶Tolacc的酶学性质比较 |
| 4.4.3 东方栓孔菌固定化漆酶Tolacc的连续使用性 |
| 4.4.4 游离和固定化漆酶Tolacc对环境激素类化合物的降解 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 本论文的创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介1 |
| 导师简介2 |
| 攻读硕士学位期间学术成果清单 |
| 致谢 |
四、多孔菌漆酶性质研究（论文参考文献）
- [1]白腐真菌Leiotrametes lactinea漆酶的分离纯化及其降解染料的研究[D]. 徐圣东. 山东农业大学, 2021(01)
- [2]灵芝属漆酶高产菌株的筛选及其所产漆酶的纯化和性质分析[D]. 吴怡. 北京林业大学, 2020(02)
- [3]真菌漆酶的性质、生产、纯化及固定化研究进展[J]. 吴怡,马鸿飞,曹永佳,司静,崔宝凯. 生物技术通报, 2019(09)
- [4]高寒草地土壤产漆酶真菌筛选及其生物功能的研究[D]. 李欣. 青海大学, 2019(04)
- [5]菌核多孔菌培养特性及驯化栽培[J]. 程国辉,安小亚,王旭,张波,李玉. 菌物学报, 2018(06)
- [6]毛栓菌漆酶分离纯化、介体系统及污染降解应用[D]. 胡渤洋. 北京农学院, 2018(01)
- [7]白腐真菌处理秸秆纤维素乙醇废水的试验研究[D]. 李佳谣. 东北林业大学, 2018(02)
- [8]处理秸秆纤维素乙醇废水的东北土着白腐真菌筛选优化研究[D]. 刘丽荣. 东北林业大学, 2018(02)
- [9]野生多孔菌分离、鉴定与漆酶的分离纯化和基因克隆[D]. 王寿南. 北京农学院, 2017(01)
- [10]东方栓孔菌漆酶的纯化及对环境激素的降解[D]. 郑飞. 北京林业大学, 2017(04)