一、棉铃虫单核衣壳核多角体病毒3个bro基因的原核表达与抗体制备（论文文献综述）
安丽[1]（2021）在《F蛋白与SeNPC1在SeMNPV感染宿主吸附阶段及在对杆状病毒超感染排斥中的作用》文中研究指明甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）危害包括白菜、花椰菜、青菜等多种农作物,其分布广泛且具较强的、间歇性的爆发性,对农业经济造成严重损失。杆状病毒专一性感染节肢动物,致病性强且对人畜无害,作为生物杀虫剂广泛应用于防治森林和农作物害虫。甜菜夜蛾核多角体病毒（Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus,SeMNPV）作为环境友好型杀虫剂能有效控制甜菜夜蛾种群数量,利用SeMNPV对甜菜夜蛾进行生物防治备受关注。尽管病毒感染宿主通常造成宿主死亡,但某些情况下病毒不造成宿主死亡,而在宿主体内形成潜伏感染（Latent infection）。当潜伏感染细胞被相同或相似病毒二次感染时,对再次感染的病毒产生排斥,即超感染排斥（Superinfection exclusion）。该排斥机制的研究对抗病毒策略的开发具有重要意义。病毒吸附是病毒成功侵染宿主细胞的第一步。参与吸附的病毒蛋白与宿主细胞表面吸附受体的相互作用作为病毒感染的限速步骤,在病毒感染过程中具有重要作用。前期本实验室通过对SeMNPV无稀释传代建立了SeMNPV潜伏感染细胞株P8-Se301-C1,该细胞对同源SeMNPV具超感染排斥作用,但不影响异源苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,Ac MNPV）的再次感染,初步表明对SeMNPV超感染排斥在吸附阶段已产生。目前SeMNPV感染昆虫宿主细胞吸附侵染阶段机制,以及病毒吸附在超感染排斥机制中作用尚未阐明。本研究分别从病毒吸附蛋白及宿主细胞表面吸附受体两方面入手,研究SeMNPV病毒囊膜蛋白F蛋白和细胞受体SeNPC1在SeMNPV感染甜菜夜蛾细胞吸附阶段,以及P8-Se301-C1细胞对杆状病毒超感染排斥中的作用,阐明SeMNPV感染甜菜夜蛾细胞吸附阶段分子机制,初步解析P8-Se301-C1细胞对杆状病毒吸附阶段超感染排斥机制。主要研究结果如下:1.通过抗体封闭法封闭SeMNPV的F蛋白位点,病毒在Se301细胞表面的吸附量显着下降。此外,通过Bac-to-Bac系统,把Ac MNPV中的GP64蛋白替换为SeMNPV的F蛋白而构建出重组病毒v Ac WT-GP64KO-F,发现该重组病毒对Se301细胞的吸附能力显着高于野生型Ac MNPV。表明SeMNPV囊膜蛋白F蛋白不仅参与SeMNPV感染Se301细胞的吸附阶段,并且可在Ac MNPV感染Se301细胞的吸附阶段发挥重要作用。2.Ac MNPV在Se301及P8-Se301-C1细胞表面吸附量相当。而v Ac WT-GP64KO-F在P8-Se301-C1细胞表面的吸附量显着低于Se301细胞的,即,SeMNPV F蛋白替换Ac MNPV GP64后影响了P8-Se301-C1细胞对重组Ac MNPV的吸附,导致P8-Se301-C1细胞对异源病毒Ac MNPV在吸附阶段产生排斥。结果表明蛋白在P8-Se301-C1细胞对杆状病毒的超感染排斥中起着关键作用。3.免疫荧光实验结果发现在P8-Se301-C1细胞中未观察到F蛋白信号,表明P8-Se301-C1细胞中Se8转录本可能并没有翻译为F蛋白,P8-Se301-C1细胞对SeMNPV的超感染排斥并非由于F蛋白占据细胞表面吸附位点而影响二次入侵病毒吸附细胞所致。4.使用蛋白酶K和衣霉素处理Se301细胞后,SeMNPV吸附量显着下降,表明SeMNPV在Se301细胞表面的吸附受体本质为糖基化蛋白。以糖基化蛋白为筛选条件,在Se301细胞的转录组数据中挖掘并筛选获得受体相关蛋白NPC1（Niemann-Pick type C1）。无缝克隆Se301细胞Senpc1基因,生物信息学分析表明,Senpc1编码的SeNPC1蛋白为具有多个跨膜域的糖基化蛋白。5.利用NPC1抑制剂处理Se301细胞后影响SeMNPV吸附及子代病毒产量。其中,SeMNPV在细胞表面SeMNPV吸附量下降40.12%,BV产量下降约10倍,多角体产量下降94.28%。通过RNA干扰（RNA interfering）技术干扰Se301细胞中npc1转录本后,SeMNPV在细胞表面的吸附量下降44.76%,但总BV及多角体产量不受影响。以上结果表明SeNPC1蛋白参与SeMNPV感染Se301细胞的吸附阶段。6.对SeMNPV F蛋白及SeNPC1蛋白Domain C进行三级结构建模及分子对接分析,表明F蛋白与SeNPC1蛋白Domain C存在相互作用。该结果暗示F蛋白与SeNPC1分别作为病毒吸附蛋白与宿主吸附受体发生互作。荧光定量PCR检测表明,P8-Se301-C1细胞中Senpc1表达量较Se301细胞的下调5倍,推测Senpc1表达下调降低了SeMNPV对细胞的吸附,从而导致P8-Se301-C1对SeMNPV在吸附阶段的超感染排斥。
毛赋翔[2]（2020）在《热休克蛋白HSC70-4及其乙酰化修饰在家蚕杆状病毒侵染过程中的功能研究》文中指出蚕桑是浙江省具有地区优势的传统特色产业,也是浙江省农业的十大主导产业之一,对主产区的农业增效和农民增收都起着十分重要的作用。然而,家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）的侵染致病对养蚕业造成重大经济损失的主要原因之一。由于病毒与宿主间的互作机制至今未明,因此,一直以来都是病毒学领域的研究热点问题之一。在前期的杆状病毒感染家蚕BmN细胞蛋白乙酰化修饰差异组学研究中发现,热休克同源蛋白HSC70-4中5个赖氨酸位点（K77、K100、K246、K524、K557）的乙酰化修饰水平发生了变化。已有的研究结果表明:HSC70-4在BmNPV感染后期可聚集于细胞核并组装进入子代病毒粒子的结构中。因此,研究家蚕HSC70-4特异性赖氨酸位点的翻译后修饰对杆状病毒感染的影响,有助于深入了解BmNPV与宿主细胞之间互作分子机制,同时也有可能为家蚕的抗病毒育种提供新思路。在本研究中,首先克隆了编码家蚕HSC70-4（300-600aa.）蛋白的部分基因片段,并构建了原核表达载体,诱导表达后,亲和纯化,免疫兔子,获得了效价高、特异性良好的多克隆抗体。然后,通过HSP/HSC70蛋白活性抑制实验,发现BmNPV的基因组复制水平和子代病毒BVs的产出量均显着降低;与之相反,过表达HSC70-4蛋白可以促进BmNPV的基因组复制以及BVs的释放。为了进一步探究HSC70-4不同赖氨酸位点的乙酰化修饰对BmNPV复制的影响,利用重叠PCR技术对特定的赖氨酸定点突变,分别用来模拟其乙酰化（K/Q）和去乙酰化（K/R）修饰,然后利用荧光定量q PCR技术进行分析,结果显示:K77位点的去乙酰化可以显着增加BmNPV基因组的复制水平,而乙酰化修饰则会降低。进一步利用激光共聚焦显微镜观察,发现K77位点的乙酰化会阻碍其在BmNPV感染过程中的入核反应。同时,酵母双杂交与细胞共定位分析结果显示:K77位点的乙酰化修饰阻断了HSC70-4与CHIP蛋白（Carboxyl terminus of HSC70-interacting protein,CHIP）的相互作用,暗示该位点的翻译后修饰可能会影响HSC70-4行使其蛋白质降解功能,并导致病毒感染时其无法入核,进而引起BmNPV的基因组拷贝数下降。最后,利用蛋白酶体抑制剂MG132处理BmN细胞,发现蛋白酶体功能的正常发挥对病毒的复制十分关键,并且阻碍了HSC70-4在BmNPV感染过程中的核聚集与翻译后修饰对病毒基因组的复制。本研究结论:家蚕HSC70-4蛋白特异位点K77的翻译后修饰变化可显着调控BmNPV的基因组复制和组装途径。该研究成果将为今后进一步深入解析BmNPV与家蚕宿主之间互作调控机制奠定基础,同时也有可能为开发优良的抗病毒家蚕育种提供新思路。
刘鹏飞[3]（2020）在《昆虫保幼激素和核型多角体病毒膜受体的筛选》文中研究表明1.昆虫保幼激素膜上介导受体的筛选保幼激素（juvenile hormone,JH）是一种倍半萜类激素,由位于昆虫脑后的咽侧体合成并分泌,主要调控昆虫蜕皮变态和生殖等。JH发挥功能依赖于其核受体Met（Methoprene-tolerant）介导的基因组转录途径和细胞膜依赖的非基因组信号转导通路。JH核基因组转录途径中,JH结合核受体Met并与Taiman（Tai）形成转录复合体调控下游基因转录,如:Cdc、Mcm、Kr-h1、Ago等,继而调控飞蝗（Locusta migratoria）卵黄发生。其中Kr-h1是JH通路早期响应基因,能够响应JH诱导并介导L.migratoria卵黄原蛋白（Vitellogenin,Vg）合成。近年研究表明,JH能够通过G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptors,GPCRs）和受体酪氨酸激酶（receptor protein tyrosine kinase,RTKs）触发非基因组信号转导通路,与核基因组转录途径协同调控JH响应基因转录,但是相关研究并不深入。据此,本论文以JH依赖性飞蝗卵黄发生为研究对象,虫体RNAi沉默GPCR和RTK后分析JH核基因组转录途径介导的下游Kr-h1、Vg A、Vg B基因转录以及JH触发的胞内第二信使系统,以期筛选出介导JH非基因组信号转导通路的膜上受体。运用RNAi、q RT-PCR方法,虫体沉默25个GPCR基因,2个RTK基因能够显着抑制JH上调表达的Kr-h1、Vg A和Vg B基因。这些基因包括:GPCR class A成员:NYR-1、adrenergic receptor-1、CCKR-1、oxytocin-1、oxytocin-2、NTSR-1、5-HTR-1、5-HTR-2、5-HTR-3和5-HTR-4;class B成员:PTHR-1、PTHR-2、PTHR-3、PTHR-4、Methuselah-like-1、Methuselah-like-2、Methuselah-like-3、Methuselah-like-4、Methuselah-like-5和ADHR-1;class D成员:p H regulator-1;class F成员:Frizzled-1、Frizzled-2、Frizzled-3;RTK家族成员:FGFR-like-1和FGFR-like-2。并对其功能进行了分类,推测FGFR-like-1和FGFR-like-2可能参与了Akt通路;adrenergic receptor-1,CCKR-1,5-HTR-1,5-HTR-2,5-HTR-3,5-HTR-4,PTHR-1,PTHR-2,PTHR-3,PTHR-4和ADHR-1可能参与c AMP-PKA信号通路;oxytocin-1,oxytocin-2,NYR-1和NTSR-1可能参与DAG-PKC通路。而Frizzled-1,Frizzled-2,Frizzled-3属于膜受体Fz,直接参与Wnt-β-caterin信号通路。其他基因类型与功能尚不明确。通过ELISA测定JH诱导胞内c AMP浓度结果显示,ds RNA注射沉默FGFR-like-1和FGFR-like-2能够显着抑制JH上调的胞内c AMP浓度,说明FGFR-like-1和FGFR-like-2能够介导JH触发的胞内c AMP第二信使通路。再以c AMP变化量为标准,用ELISA筛选出两个基因。本论文研究结果初步筛选出能够介导JH信号通路的25个GPCR基因和2个RTK基因,可以为进一步开展JH非基因组信号通路研究奠定基础,丰富JH信号通路调控昆虫生殖的研究进展。2.核型多角体病毒膜受体的筛选核型多角体病毒（Nucleopolyhedrovirus,NPV）属于杆状病毒,是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒,在自然界中以节肢动物作为专一性宿主进行感染和传播。杆状病毒不仅可以因为其特异性和对人体无害性而作为杀虫剂被广泛应用,在真核表达系统、基因治疗、以及基因工程疫苗等方面也都有重要的实际应用。NPV具有双相复制周期,会产生两种具有不同形态和不同功能的病毒粒子,即包涵体来源型病毒（Occlusion derived virus,ODV）和出芽型病毒（Budded virus,BV）。ODV包涵于多角体中,负责宿主个体之间的感染过程;BV由ODV产生,负责宿主体内各组织间的感染过程。感染过程从多角体进入宿主体内开始,多角体在宿主中肠碱性环境中释放ODV,ODV进入宿主上皮细胞,在细胞核进行病毒的转录和翻译,新生的BV粒子从基底膜出芽引起全身感染。在继发感染过程中,BV粒子的囊膜蛋白起到了至关重要的作用,由BV囊膜蛋白结合宿主细胞表面膜受体从而进入宿主细胞。这个囊膜蛋白在组Ⅰ核型多角体病毒中是GP64,而在组Ⅱ中是F蛋白。目前对于BV如何进入宿主细胞内一直存有疑问,与BV囊膜蛋白结合的膜受体也一直不明。C型凝集素是一类钙依赖性糖结合蛋白,其功能是作为模式识别受体识别非己成分,调节细胞的吞噬作用和粘连反应,增强细胞黑化作用和包囊作用,抑制或加速病毒在体内的增殖。在本实验组前期的工作中表明BV能够诱导棉铃虫C型凝集素（Helicoverpa armigera Lectin,Ha-lectin）的表达BV囊膜融合蛋白F（NPVF）与分泌性C型凝集素存在相互作用,我们推断棉铃虫细胞膜上可能存在特异的受体蛋白,能够与C型凝集素互作,通过招募C型凝集素,递呈BV到细胞表面受体,增强或抑制病毒粒子的内吞。综上所述,本论文通过棉柃虫（Helicoverpaarmigera）为研究对象,围绕BV囊膜蛋白与C型凝集素与宿主细胞膜受体三者之间的关系展开对核型多角体病毒膜受体的筛选工作。本论文使用的棉铃虫核型多角体病毒（Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,Ha NPV）属于组Ⅱ。本论文在本实验室早期对Ha-lectin与NPVF关系的研究的基础上,对其质谱结果进行了初期筛选,筛选出了疑似膜受体VHDLR。之后利用免疫荧光、Co-IP、Western blot、RNAi等细胞生物学、分子生物学和遗传学的方法,对VHDLR进行鉴定和分析。确定了VHDLR是与BV囊膜蛋白NPVF结合的宿主细胞表面膜受体。推测三者之间的作用机制为Ha-lectin在血淋巴组织中捕获BV病毒粒子,将其呈递到宿主细胞膜表面,使BV囊膜蛋白NPVF与宿主细胞膜受体VHDLR结合,从而使BV病粒子进入宿主细胞内。并且通过制备VHDLR各组分的表达载体,在H-O细胞系内验证了VHDLR各组分与Ha-lectin、NPVF的关系。确定NPVF是与VHDLR内的C Domain结合,Ha-lectin不与VHDLR结合。对于揭示杆状病毒进入宿主细胞的机制是全新的研究,也为接下来筛选组Ⅰ的GP64的膜受体的研究奠定了基础。
时敏,唐璞,王知知,黄健华,陈学新[4]（2020）在《中国寄生蜂研究及其在害虫生物防治中的应用》文中研究指明寄生蜂是一类重要的寄生性天敌昆虫,种类繁多、习性复杂,在害虫生物防治和综合治理中发挥着极其重要的作用。在产卵时,寄生蜂携带的毒液、多DNA病毒等寄生因子就会随之进入寄主体内,发挥调控寄主生长、发育、免疫、代谢、行为的作用,从而保障了寄生蜂后代的发育。本文主要针对我国寄生蜂的系统分类、资源普查、生物学、生态学、寄主调控、人工繁殖、释放应用、田间保护和助增等方面的基础研究和应用进行了概述和整理。
何磊[5]（2019）在《烟芽夜蛾囊泡病毒3h株对甜菜夜蛾几丁质酶活性和表达的影响》文中研究说明几丁质酶是昆虫蜕皮过程中极为重要的参与者与调控者,其正常的代谢对于昆虫生长发育具有至关重要的作用。囊泡病毒作为一种具有较大生防潜力的昆虫病毒,已有研究表明其会造成宿主幼虫生长历期延长、蜕皮困难、无法化蛹的现象。这些现象指示着宿主幼虫几丁质酶的代谢极有可能受到了囊泡病毒的影响。基于此,本研究以期通过对甜菜夜蛾转录组数据的筛选,获得在宿主幼虫感染烟芽夜蛾囊泡病毒3h株（Heliothis virescens ascovirus 3h,HvAV-3h）后显着差异表达的几丁质酶基因。然后通过对HvAV-3h感染和模拟感染幼虫几丁质酶活性及转录、表达模式的分析,从而探明HvAV-3h对宿主几丁质酶的调控,主要研究结果如下:1、甜菜夜蛾几丁质酶基因的克隆与系统发育分析:基于已报道的甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）转录组数据,经过筛选和RT-PCR验证最终获得了HvAV-3h感染后显着差异表达的5个几丁质酶基因（S.exigua chitinase,SeCHIT）和1个几丁质结合域基因（S.exigua chitin-binding domain,SeCBD）。通过分子特征和系统发育分析结果表明:这5个SeCHIT分别命名为SeCHIT7、SeCHIT11、SeCHIT12、SeCHIT13和SeCHIT14,其中SeCHIT7属于III型几丁质酶,而SeCHIT11、SeCHIT12、SeCHIT13和SeCHIT14属于VIII型几丁质酶。2、甜菜夜蛾几丁质酶的原核表达及其多克隆抗体的制备:通过大肠杆菌表达系统成功表达获得了SeCHIT7N（SeCHIT7的N端）、SeCHIT11、SeCHIT12和SeCBD的纯化蛋白,并测定了其活性。结果表明:SeCHIT7N的几丁质酶活性>SeCHIT11>SeCHIT12,而SeCBD无几丁质酶活性。但是SeCBD的存在可以提高3个SeCHIT的几丁质酶活性。最后获得了特异性较高的SeCHIT7N、SeCHIT11和SeCBD的多克隆抗体。3、HvAV-3h对甜菜夜蛾几丁质酶活性影响的检测:测定了健康甜菜夜蛾不同发育阶段和不同组织中几丁质酶的活性,结果表明:从卵到1龄幼虫几丁质酶活性升高了9.4倍。4龄和5龄幼虫的几丁质酶活性高于1龄、2龄、3龄幼虫,蛹中几丁质酶活性最高（113.77 Unit）。在4个组织中酶活性高低依次为:脂肪体>表皮>中肠>血淋巴。通过比较HvAV-3h感染和模拟感染幼虫不同发育时间和不同组织中几丁质酶的活性,结果表明:在HvAV-3h感染48、72、96、120、144、168 h后,感毒幼虫的几丁质酶活性分别为模拟感染幼虫的13.20%、6.37%、5.63%、10.49%、11.79%和7.94%。在4个组织中,HvAV-3h导致宿主几丁质酶活性在168 hpi显着低于模拟感染幼虫,分别降低了87.95%（血淋巴）、96.96%（脂肪体）、76.84%（中肠）和95.86%（表皮）。4、HvAV-3h对甜菜夜蛾几丁质酶转录、表达影响的检测:通过荧光定量PCR和Western blot的方法检测了健康幼虫不同发育阶段和不同组织中3个SeCHIT（SeCHIT7、SeCHIT11和SeCHIT12）的转录、表达水平。结果表明:SeCHIT7在5龄幼虫体内检测到最丰富的转录本;SeCHIT11和SeCHIT12在幼虫期表现出相似的转录模式,即从1龄幼虫到3龄幼虫转录水平逐渐升高,随后降低;SeCHIT11在卵中转录水平最高,而SeCHIT12在蛹中转录水平最高。在4个组织中,3个SeCHIT的转录均可被检测到,其中主要在中肠中转录,其次是脂肪体。然后通过比较HvAV-3h感染和模拟感染幼虫不同发育时间全虫中3个SeCHIT的转录水平,发现HvAV-3h导致SeCHIT7在6、9、12、48、72和96 hpi的转录水平显着降低,而SeCHIT11和SeCHIT12在3-96 hpi的转录水平降低;在120-168 hpi,3个SeCHIT的转录水平均显着升高。其中SeCHIT7在96 hpi下降了99.94%,而在120 hpi比模拟感染的幼虫高1300倍以上;与模拟感染幼虫相比,在感毒幼虫体内SeCHIT11的转录水平在6 hpi降低了99.98%,而在168 hpi增加了25.15倍;SeCHIT12的转录水平在6 hpi被HvAV-3h完全抑制,而在120 hpi升高了40.10倍。在不同组织中的转录分析表明HvAV-3h显着影响了3个SeCHIT在甜菜夜蛾幼虫血淋巴、脂肪体、中肠和表皮中的转录模式,特别是SeCHIT7在脂肪体和表皮中的转录以及SeCHIT12在脂肪体中的转录被显着抑制。本研究首先获得了HvAV-3h感染引起显着差异表达的5个甜菜夜蛾几丁质酶基因,并对其分子特征进行了分析描述,然后比较了HvAV-3h感染与模拟感染幼虫体内几丁质酶的活性差异,最后对SeCHIT7、SeCHIT11和SeCHIT12等3个基因的转录、表达进行了时空特异性分析,从而揭示HvAV-3h对甜菜夜蛾几丁质酶的调控机制,最终为HvAV-3h致病机制的研究奠定了一定的基础。
唐琦[6]（2013）在《可用作生物杀虫剂的家蚕核型多角体病毒orf65、orf91的基因功能分析》文中研究表明家蚕是经济昆虫,它除了抽丝结茧,制造丝绸外,目前用家蚕作为食品及副产物的综合利用越来越多。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）是家蚕的主要病原体,每年,对我国的桑蚕业造成了巨大损失。然而,经过改造的重组杆状病毒作为生物杀虫剂却能够减少农作物、食品中农药的残留及保护环境,因而已经逐渐取代传统的化学农药,广泛应用于农林防护。目前,越来越多的杆状病毒基因相继被研究报道。BmNPV基因组中还有部分基因功能未知,对这些未知功能的基因进行研究,有助于我们更加深入、全面地了解病毒自身增殖和侵染宿主的机制。基于这些理论,从分子水平上改造、修饰或替换掉某些基因,构建重组型的杆状病毒,从而更好地利用杆状病毒表达系统,或作为生物杀虫剂防治农林害虫。本研究选取了家蚕核型多角体病毒的早期基因（Bm65）和晚期基因（Bm91）为研究对象,分别从转录水平、表达水平、亚细胞定位、病毒结构定位等方面来探讨这些基因的基本特性。通过同源重组构建了相应的基因缺失型病毒,进一步对基因功能进行了研究。研究的结果主要如下：一.Bm65基因功能1.生物信息学分析发现Bm65在鳞翅目核型多角体病毒基因组中高度保守。序列分析发现一个典型的早期转录基序TATA位于起始密码子上游,预示Bm65可能为早期基因。Bm65编码一个含有104个氨基酸残基,理论分子量为12.2kDa的蛋白。InterProScan软件分析结果显示,Bm65蛋白属于一个功能未知的GIY-YIG核酸内切酶超家族,推测该基因可能与病毒DNA复制有关。2.利用大肠杆菌表达系统表达Bm65蛋白,制备了抗血清。此外,利用AcMNPV在sf9细胞中真核表达Bm65蛋白,为下一步该蛋白的纯化及体外内切酶活性的鉴定提供基础。3.转录时相分析显示Bm65的转录从病毒感染宿主细胞6h后开始到感染后72h.5’RACE分析显示Bm65只有一个位于ATG上游14个核苷酸处的转录起始位点。荧光共聚焦显微镜观察发现Bm65既位于感染后宿主的细胞质又位于细胞核。4.利用Red重组系统,用Cm基因成功地取代了Bm65后,通过抗性筛选得到缺失型病毒,并通过转座的方式获得带有polh和gfp的野生型、Bm65缺失型、补回型病毒。利用重组型病毒转染细胞后,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况,结果显示Bm65缺失后不能产生有感染性的病毒粒子。荧光定量PCR结果进一步证明Bm65缺失后不影响病毒DNA的复制。以上结果表明Bm65为病毒增殖的必需基因,但对于病毒DNA的复制而言是非必需的。二.Bm91基因功能1.Bm91被预测是一个包含105个氨基酸残基、理论分子量为11.8kDa的蛋白,在鳞翅目核型多角体病毒中高度保守。一个典型的晚期转录基序TAAG位于起始密码子上游13个核苷酸处,预示Bm91可能为晚期基因。软件分析结果显示,Bm91属于一个功能未知的杆状病毒11kDa蛋白家族,推测该基因可能与病毒粒子的形成有关。2.原核表达Bm91蛋白,制备多克隆抗体。转录分析表明,Bm91在病毒感染宿主细胞12h后开始转录,一直持续到感染后96h,且只有一个位于起始密码子ATG上游12个核苷酸处的转录起始位点。从病毒感染BmN细胞后24h开始到96h都能在病毒感染的细胞中检测到Bm91的表达。亚细胞定位显示Bm91定位于病毒感染后的BmN细胞的细胞质和细胞核。免疫印迹实验结果表明Bm91是ODV囊膜上的特异性蛋白。N-糖基化抑制实验显示Bm91未经过N-糖基化修饰。3.成功构建了Bm91缺失型病毒,通过转座得到带有polh和gfp的Bm91缺失型、补回型重组病毒。进一步的转染和感染实验发现,Bm91缺失后不影响有感染性的病毒粒子的产生,且该基因缺失后产生的BV较野生型病毒相比,滴度没有明显的变化。幼虫生物学测试实验显示缺失该基因不影响重组病毒感染宿主幼虫的半数致死剂量LD50,却使得宿主幼虫的半数致死时间LT5o延长了24h,提示Bm91为病毒增殖的非必需基因,但该基因可能与病毒毒力有关。以上结果在分子水平上补充和丰富了BmNPV基因功能的研究情况,为全面了解病毒的感染和增殖机制打下基础,也为该病毒的改造和利用提供理论依据。
盛晔[7]（2010）在《斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型（SpltMNPV Ⅱ）BV、ODV组成型蛋白质谱分析和4种ORF的基因分析》文中研究指明斜纹夜蛾（Spodoptera litura, Spli）属鳞翅目夜蛾科,是一种杂食性农业和林业害虫,主要危害甘蓝、白菜、藕、芋、蕹菜、苋菜、马铃薯、茄子、辣椒、番茄、豆类、瓜类以及葱韭等。由于斜纹夜蛾的食性杂、世代重叠、抗性强,因此防治难度高。在各种化学合成杀虫剂严重污染环境,害虫对化学合成杀虫剂抗性日益增强的情况下,生物防治越显重要和迫切。从自然界中寻找和筛选新的高毒力的病毒株系是开发NPV生物杀虫剂的重要途径。SpltMNPVⅡ是一种繁殖率和毒力极强的新的病毒变异株。该病毒株的基因组全序列已经测定完成。但病毒BV和ODV的组成蛋白并不清楚,论文对SpltMNPVⅡBV和ODV进行了质谱分析,确定了BV和ODV蛋白组成,并对组成蛋白基因的中的ORF6、ORF13、ORF57和ORF146进行了启动子活性分析,转录时相和表达时相分析,对ORF57基因的部分功能进行了鉴定。主要研究结果与发现:1.用二级质谱分析方法对SpltMNPVⅡBV和ODV的组成蛋白进行了研究,确定了SpltMNPVⅡBV由42种蛋白组成,通过与已知杆状病毒同源基因的比较,确定了其中26种蛋白基因的部分功能;SpltMNPVⅡODV由46种蛋白组成,与已知杆状病毒同源基因的比较,确定了其中24种蛋白基因的部分功能。2.对SpltMNPVⅡORF6、ORF13、ORF57和ORF146基因结构进行了分析。ORF6基因全长1509 bp,编码502 aa,预测蛋白分子量为55.0 kDa。该基因既有早期启动子基序CAGT,又有晚期启动子基序ATAAG,推测该基因可能是一个在病毒生命周期中早晚期都表达的基因;ORF13基因读码框全长333 bp,编码110 aa,理论预测蛋白分子量为12.2 kDa。起始密码子ATG上游发现有一个TATA box和杆状病毒晚期启动子基序ATAAG,没有发现明显的早期启动子基序;ORF57基因全长1098 bp,编码365 aa,预测蛋白分子量为42.6 kDa。起始密码子ATG上游发现有一个TATA box,在起始密码子上游没有发现明显的早期和晚期启动子基序;ORF146基因涵盖了1383 bp的读码框,编码460 aa,理论预测蛋白分子量为50.2 kDa。该基因起始密码子ATG上游发现有一个TATA box,一个晚期启动子基序ATAAG。3.对SpltMNPVⅡORF6、ORF13、ORF57和ORF146基因的启动子活性和转录时相进行了分析。发现这4个基因是在病毒生命周期的早期和晚期都有转录的基因。其中ORF13和ORF146基因能被SpltMNPVⅡ病毒编码的反式作用因子所激活,在感染后期能提高转录水平。而ORF6基因也能被SpltMNPVⅡ病毒编码的反式作用因子所激活,但是为负调控,在感染后期转录水平有明显下降。4.对SpltMNPVⅡORF6、ORF13和ORF146基因的部分序列进行了原核表达,表达产物经纯化和质谱鉴定后,免疫豚鼠制作了多克隆抗体。抗体效价用ELISA进行测定,3个基因的表达产物制作的抗体效价都在1:2500以上。5.以制备的多克隆抗体为一抗,对SpltMNPVⅡORF6、ORF13和ORF146基因在宿主细胞的表达产物进行了表达时相分析。0RF6基因产物最早在病毒感染细胞后8 h出现,0RF146基因产物最早在病毒感染细胞后4 h出现,并且后期都有表达,说明这两个基因都是早期和晚期均表达的基因,与它们的启动子分析和转录时相分析结果一致。而ORF13最早在出现病毒感染细胞后12 h,并一直持续到后期,说明ORF13为晚期表达基因。但是ORF13的启动子活性分析和转录时相分析都表明该基因是个早晚期都表达的基因。可能是由于该基因在表达的初始阶段,蛋白合成量和积累水平比较低,还不足以检测出来的缘故。6.克隆和表达了SpltMNPVⅡORF57基因的完整ORF,纯化的表达产物用质谱进行了鉴定。采用同位素法和痕量磷特异检测方法（孔雀石绿检测试剂法）确定了ORF57基因是一个双功能酶基因,该基因编码的蛋白既具有多聚核苷酸激酶功能,又具有3’磷酸酶功能。
周阳[8]（2010）在《家蚕核型多角体病毒（BmNPV）Bm5的基因分析及利用基因芯片筛选抗BmNPV相关基因》文中研究表明家蚕是重要的经济昆虫,也是家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）的天然宿主。家蚕核型多角体病毒是引起家蚕病毒严重感染的关键病原之一,病毒与宿主的相互博弈一直是研究者们关注的问题。家蚕抗NPV机制至今尚未完全明确,但究其病因可归因于宿主与致病病毒两方面因素。本研究以BmNPV核心基因Bm5为研究对象,从基因的转录、表达、亚细胞定位、病毒结构定位和基因缺失等方面,研究基因的基本特性及其功能。同时使用家蚕高密度Oligo表达谱芯片所提供了相关基因的基因组学的证据,突破了以往单个基因孤立研究的局限,在全基因组范围内筛选家蚕抗NPV相关基因,对筛选出基因进行GO和Pathway分析,并进一步用半定量PCR和荧光定量PCR进行验证,探讨家蚕抗NPV的途径和机理。论文主要结论如下：1.BmNPV的orf5（Bm5）位于基因组4,605--5,600 nt,全长993 bp,编码一个含331个氨基酸残基的蛋白,预测分子量约为39.3 kDa,Bm5是AcMNPV orf13的同源序列。在Bm5基因ATG上游存在杆状病毒晚期转录基序ATAAG,在终止密码子TAA下游发现转录终止信号AATAAA,暗示了该基因是晚期表达基因。根据Bm5基因序列设计引物,分别以BmNP基因组DNA为模板进行PCR扩增,将得到的基因克隆至原核表达载体pET30a（+）,在原核细胞中实现了基因的融合表达。纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,制备了BM5蛋白的多克隆抗体。2. RT-PCR分析发现,Bm5在病毒感染宿主细胞12 h开始转录,直到72 h。利用抗体进行Western blot分析,发现Bm5的表达产物在病毒感染宿主细胞后24 h被检测出来,一直持续72 h都有表达,大小为39.3kDa,与预测的大小一致,说明Bm5是一个晚期表达基因,而且没有转录后修饰。Western blot方法检测分离出的BV、ODV粒子,表明BM5不是病毒粒子的结构蛋白。利用抗体检测发现BM5定位在细胞质中。3.利用Red重组系统在大肠杆菌中成功地对BmNPV的Bm5基因进行了快速定点敲除。并BmNPV/Bac-to-Bac系统和Red重组系统结合在一起,对敲除了Bm5基因的BmNPV:进行了拯救。分别构建了野生型病毒vBm5-Wt、Bm5基因缺失病毒vBm5-Ko和Bm5基因拯救病毒vBm5-Re。4.应用基因芯片技术在家蚕抗NPV品系BC8、感性品系306中筛查抗性相关基因,结果发现93个差异表达基因其中表达上调基因44个,下调基因49个。GO分析表明93个基因中51个其中24个上调基因、27个下调基因具有功能注释。GO分析结果显示分子功能方面主要有酶活性、氧化还原活性、酶绑定、结构成分、转运活性等；生物进程方面主要有新陈代谢、蛋白质水解、电子转移、蛋白质定位、转移、蛋白质生物等功能；细胞组分方面主要有细胞内、膜核糖体、胞外区等。Pathway分析表明有新陈代谢、果糖和甘露糖代谢、丙酸代谢、核糖体、氧化磷酸化、磷酸戊糖途径、糖酵解/糖异和柠檬酸循环（TCA循环）等通路。5.为了验证芯片筛选出差异表达基因,从93个差异基因挑选14个表达量差异大基因（9个上调基因、5个下调基因）进行RT-PCR,依据结果再从14个基因中挑选10个差异基因（7个上调基因、3个下调基因）进行荧光定量PCR。结果表明了7个上调基因中5个基因在NB、BC8各时间点的表达量高于306,鉴定为抗性相关上调基因,2个基因在BC8表达量高于NB、306。3个下调基因在306的表达量要高于NB、BC8,鉴定为抗性相关下调基因。表明荧光定量PCR试验结果与芯片结果具有良好的一致性,进一步证实了芯片结果的可靠性。
李志远,邱小慧,周玥,钱丽莹,徐旭士[9]（2008）在《棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒HaSNPV orf101的原核表达及抗体制备》文中研究表明[目的]摸索棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒（HaSNPV）orf101编码蛋白原核表达条件并制备其多克隆抗体。[方法]根据HaS-NPVorf101序列,设计引物,引入适当的酶切位点,利用PCR扩增出基因片段并将其克隆至pGEM-TEasy载体,然后亚克隆至原核表达载体pGEX-KG,检测在不同条件下融合蛋白的表达产量及其折叠性质。原核表达产物经SDS-PAGE分离纯化,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。[结果]在IPTG诱导的条件下,融合蛋白GST-HA101可在大肠杆菌BL21中以包涵体形式高效表达,表达产物的大小为55.8 kDa。制备的多克隆抗体经1∶8 000倍稀释后用于Western Blot分析,获得特异性显色信号。[结论]原核表达蛋白及其多克隆抗体的获得为深入研究Ha101的基因功能打下了基础。
周玥[10]（2007）在《棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒（HaSNPV）orf44基因的研究》文中指出棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒（Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus，HaSNPV）是一类双链环状DNA病毒，其分子生物学和基因功能研究已取得很大进展。开放阅读框44（open reading frame 44，orf44）是HaSNPV的一个功能未知的结构基因，本文首次对HaSNPV G4株基因组中的orf44基因进行研究报道。orf44基因和Ha44蛋白序列通过生物信息学分析表明：orf44基因长1137bp，预计编码378个氨基酸，预测蛋白质分子大小为42KDa；orf44基因起始密码子上游-80和-88位分别存在晚期启动子信号TAAG和早期启动子信号TATA；基因没有明确的功能结构域；通过PSI-BLAST比对发现，Ha44有多种杆状病毒同源蛋白，这些蛋白存在于groupⅡNPV或颗粒体病毒属（Granulovirus，GV）中，其相应的功能还未知。本试验中，我们用表达载体pGEX-KG及表达宿主大肠杆菌BL21对orf44基因进行谷胱甘肽（GST）融合表达，表达产物约为68KDa，与预期的大小相符。表达蛋白经初步纯化（包涵体纯化和凝胶电泳分离相结合），免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。经ELISA和western-blot检测，获得了特异性较强的抗体，为进一步orf44基因的表达时相分析作准备。我们利用荧光蛋白基因egfp作为报告基因，将orf44和egfp连接在真核表达载体pIZ/V5-His上，形成融合表达产物，转染美洲棉铃虫细胞HzMAl，观察GFP在荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下绿色荧光的分布位置，将orf44基因表达产物Ha44定位于细胞核，这表明该蛋白可能是病毒的重要结构基因，参与病毒基因复制与增殖。为研究orf44基因的功能，我们通过同源重组在原核水平将该基因敲除，构建orf44基因缺失型重组病毒。即设计一对70bp，含有orf44基因同源臂的引物，以PCR的方法合成可供同源交换的线性片段Phsp70-egfp-SV40-Cmr，借助含有λ噬菌体Red重组系统的质粒pKD46及棉铃虫杆状病毒细菌人工染色体HaBacmid，在大肠杆菌BW25113中进行同源重组。通过PCR及酶切鉴定，我们得到了HaSNPV orf44基因缺失型重组病毒，为进一步在昆虫细胞水平研究此基因的功能奠定了基础。
二、棉铃虫单核衣壳核多角体病毒3个bro基因的原核表达与抗体制备（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、棉铃虫单核衣壳核多角体病毒3个bro基因的原核表达与抗体制备（论文提纲范文）
（1）F蛋白与SeNPC1在SeMNPV感染宿主吸附阶段及在对杆状病毒超感染排斥中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒概述 |
| 1.1.1 杆状病毒及其分类 |
| 1.1.2 杆状病毒的应用 |
| 1.1.3 杆状病毒的生活周期及感染细胞过程中主要功能基因 |
| 1.2 病毒的隐性感染 |
| 1.2.1 隐性感染 |
| 1.2.2 病毒的超感染排斥及研究意义 |
| 1.2.3 病毒超感染排斥的机制 |
| 1.2.4 昆虫病毒的超感染排斥及其机制 |
| 1.3 超感染排斥研究目的与意义 |
| 1.4 病毒受体及NPC1 |
| 1.4.1 病毒入侵宿主细胞 |
| 1.4.2 昆虫NPC1 概述 |
| 1.4.3 NPC1 在病毒侵染宿主细胞过程中的作用 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 F蛋白在病毒吸附阶段及P8-Se301-C1 对杆状病毒超感染排斥中的作用 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验设备 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 P8-Se301-C1 细胞对SeMNPV超感染排斥发生在吸附阶段的验证 |
| 2.2.2 SeMNPV F蛋白对宿主Se301 细胞表面SeMNPV BV吸附量的影响 |
| 2.2.3 F蛋白在P8-Se301-C1 细胞对杆状病毒超感染排斥中的作用 |
| 2.2.4 P8-Se301-C1 细胞中Se8 转录未翻译为F蛋白参与超感染排斥 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 P8-Se301-C1 对 Se MNPV 超感染排斥发生在吸附阶段 |
| 2.3.2 囊膜蛋白F参与SeMNPV感染甜菜夜蛾细胞Se301 的吸附和膜融合两个阶段 |
| 2.3.3 Ac MNPV在不同昆虫细胞表面吸附量不同 |
| 2.3.4 F蛋白参与P8-Se301-C1 细胞对杆状病毒吸附阶段的超感染排斥 |
| 2.3.5 P8-Se301-C1 细胞中的Se8 转录本未翻译为F蛋白 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 宿主Se301 细胞表面SeMNPV病毒受体本质的鉴定 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验设备 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 神经氨酸酶、蛋白酶K及衣霉素药物使用浓度筛选 |
| 3.2.2 SeMPV BV感染宿主细胞吸附的受体本质为蛋白质 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 甜菜夜蛾 SeNPC1 蛋白在SeMNPV感染甜菜夜蛾 Se301 细胞中的作用 |
| 4.1 实验材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验设备 |
| 4.1.4 实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 甜菜夜蛾Senpc1 基因的克隆鉴定 |
| 4.2.2 甜菜夜蛾SeNPC1 的生物信息学分析 |
| 4.2.3 SeNPC1在SeMNPV感染Se301 细胞中的作用 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 甜菜夜蛾Senpc1 鉴定及分析 |
| 4.3.2 甜菜夜蛾SeNPC1 参与SeMNPV感染Se301 细胞的吸附阶段 |
| 4.3.3 SeNPC1 可能参与P8-Se301-C1 细胞对SeMNPV吸附阶段的超感染排斥 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 SeMNPV F蛋白与SeNPC1 的生物信息学互作分析 |
| 5.1 实验材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 F蛋白与SeNPC1 蛋白三级结构建模 |
| 5.2.2 SeMNPV F蛋白与SeNPC1 Domain C蛋白模型质量评估分析 |
| 5.2.3 F蛋白与SeNPC1 蛋白Domain C分子对接及相互作用分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间主要研究成果 |
（2）热休克蛋白HSC70-4及其乙酰化修饰在家蚕杆状病毒侵染过程中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1.家蚕与杆状病毒 |
| 2.杆状病毒感染的分子机制 |
| 3.热休克蛋白70与杆状病毒 |
| 4.乙酰化修饰调控热休克蛋白70功能的机制 |
| 4.1 HSP70 乙酰化与其ATP酶结构域活性 |
| 4.2 HSP70乙酰化与其相互作用蛋白的关系 |
| 4.3 HSP70乙酰化与细胞自噬、细胞凋亡 |
| 5.热休克蛋白乙酰化修饰应答病毒感染 |
| 第二章 实验设计方案 |
| 1.研究目的与意义 |
| 2.研究的主要内容 |
| 3.技术路线 |
| 第三章 家蚕HSC70-4相关表达载体的构建及抗体制备 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞、菌株、质粒和动物 |
| 1.2 试剂、仪器设备和技术支持 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 家蚕BmN细胞的总RNA提取 |
| 2.2 BmN细胞cDNA的逆转录合成 |
| 2.3 家蚕HSC70-4基因的扩增 |
| 2.4 重组载体的构建及鉴定 |
| 2.5 家蚕HSC70-4片段蛋白的诱导表达 |
| 2.6 家蚕HSC70-4片段蛋白的亲和纯化 |
| 2.7 家蚕HSC70-4多克隆抗体的制备 |
| 2.8 多克隆抗体效价及特异性的检测 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 基因克隆及其载体构建 |
| 3.2 家蚕HSC70-4蛋白的诱导表达及其免疫抗体的检测 |
| 4.讨论 |
| 第四章 家蚕HSC70-4对BmNPV增殖的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 病毒株与相关抗体 |
| 1.2 试剂与仪器设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 瞬时表达载体的转染 |
| 2.2 MTT法测定细胞活力 |
| 2.3 Western blotting |
| 2.4 qPCR检测病毒基因组复制 |
| 2.5 荧光显微镜观测BmNPV-EGFP扩增 |
| 2.6 病毒滴度的测定 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 HSP/HSC70 抑制剂VER155008对BmNP V增殖的影响 |
| 3.2 过表达家蚕HSC70-4对BmNPV增殖的影响 |
| 4.讨论 |
| 第五章 家蚕HSC70-4乙酰化修饰对病毒增殖的调控 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 试剂与设备 |
| 1.2 试剂的配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 赖氨酸位点保守性分析 |
| 2.2 病毒基因组提取及qPCR分析 |
| 2.3 激光共聚焦显微镜 |
| 2.4 酵母双杂交 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 家蚕HSC70-4赖氨酸位点的正负突变与保守性分析 |
| 3.2 家蚕HSC70-4突变体对病毒基因组复制的影响 |
| 3.3 K77 去乙酰化对 HSC70-4 蛋白在 BmNPV 感染的细胞中稳定性与定位变化 |
| 3.4 K77 去乙酰化促进家蚕HSC70-4与CHIP相互作用 |
| 3.5 K77去乙酰化利用蛋白酶体通路影响病毒的扩增 |
| 4.讨论 |
| 结论 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）昆虫保幼激素和核型多角体病毒膜受体的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 筛选和鉴定飞蝗JH的膜上受体 |
| 1.引言 |
| 1.1 保幼激素信号通路与昆虫发育调控 |
| 1.1.1 保幼激素 |
| 1.1.2 保幼激素核信号通路 |
| 1.1.3 保幼激素非基因组信号通路 |
| 1.2 G蛋白偶联受体和受体酪氨酸激酶 |
| 1.3 研究意义与研究方法 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 昆虫 |
| 2.2 昆虫的解剖 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 主要实验仪器 |
| 2.5 引物设计与合成 |
| 2.6 总RNA的提取 |
| 2.7 mRNA反转录 |
| 2.8 双链RNA的合成与纯化 |
| 2.9 飞蝗内源JH剥夺与JHA处理 |
| 2.10 RNA干扰 |
| 2.11 Real-time qPCR |
| 2.12 cAMP ELISA检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 激素诱导条件优化 |
| 3.2 候选基因的筛选过程 |
| 3.3 cAMP检测结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第二章 筛选和鉴定棉铃虫HaNPV的膜受体 |
| 1.引言 |
| 1.1 棉铃虫核型多角体病毒 |
| 1.2 C型凝集素对棉铃虫核型多角体病毒的影响 |
| 1.3 研究意义与研究内容 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验对象 |
| 2.2 菌株 |
| 2.3 细胞 |
| 2.4 实验试剂及配置方法 |
| 2.5 主要试验仪器 |
| 2.6 引物设计与合成 |
| 2.7 棉铃虫总RNA提取 |
| 2.8 cDNA的合成 |
| 2.9 基因扩增 |
| 2.10 凝胶电泳检测 |
| 2.11 使用PCR产物回收试剂盒回收目的片段 |
| 2.12 pET-32a质粒与PCR回收产物的双酶切 |
| 2.13 载体pET-32a质粒与目的基因的体外连接 |
| 2.14 转化感受态大肠杆菌细胞 |
| 2.15 菌落PCR |
| 2.16 质粒提取与双酶切检验 |
| 2.17 重新转化到表达感受态细胞并挑选成功转化菌体 |
| 2.18 少量重组蛋白诱导表达与蛋白检测 |
| 2.19 大量重组蛋白诱导表达,不可溶蛋白过柱与蛋白检测 |
| 2.20 层析 |
| 2.21 多克隆抗体制备 |
| 2.22 Western-blotting |
| 2.23 免疫细胞化学 |
| 2.24 免疫共沉淀 |
| 2.25 双链合成及RNA干扰实验 |
| 2.26 Real-time qPCR |
| 2.27 Anti-VHDLR封闭实验 |
| 3.结果 |
| 3.1 重组蛋白的表达与纯化和多克隆抗体的制备 |
| 3.2 检测BV感染对VHDLR表达的影响 |
| 3.3 VHDLR抗体封闭对BV感染的影响 |
| 3.4 VHDLR、Ha-lectin与 NPVF共定位 |
| 3.5 VHDLR、Ha-lectin与 NPVF的互作 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）中国寄生蜂研究及其在害虫生物防治中的应用（论文提纲范文）
| 1 寄生蜂的分类和资源发掘 |
| 1.1 寄生蜂的分类研究 |
| 1.2 寄生蜂的资源发掘 |
| 2 寄生蜂的生物学 |
| 2.1 幼蜂发育 |
| 2.2 寄主选择 |
| 2.3 寄主适合度 |
| 2.4 寄生效率 |
| 2.5 行为学特性 |
| 2.5.1 母代雌蜂的照料行为 |
| 2.5.2母蜂的学习经历 |
| 2.5.3 雄性蜂的争斗行为 |
| 2.5.4 寄生蜂的视觉和嗅觉 |
| 2.6 飞行和扩散 |
| 3 寄生蜂的生态学 |
| 3.1 生物因素 |
| 3.1.1 种间竞争 |
| 3.1.2植物次生代谢物质与挥发物 |
| 3.1.3 微生物 |
| 3.1.4中性昆虫 |
| 3.1.5转Bt基因抗虫作物 |
| 3.2 非生物因素 |
| 3.2.1 温湿度 |
| 3.2.2 光照和颜色 |
| 3.2.3 化学农药 |
| 3.2.4 其他因素 |
| 4 寄生蜂对寄主生理、发育、生殖、行为的调控 |
| 4.1 寄生因子及功能 |
| 4.1.1 毒液 |
| 4.1.2 多DNA病毒 |
| 4.1.3 畸形细胞 |
| 4.1.4 其他因子 |
| 4.2 寄生蜂对寄主免疫、代谢、发育、生殖、行为的影响 |
| 4.2.1 对寄主免疫的影响 |
| 4.2.2 对寄主营养代谢的影响 |
| 4.2.3 对寄主内分泌和生长发育的影响 |
| 4.2.4 对寄主生殖的影响 |
| 4.2.5 对寄主抗逆性的影响 |
| 4.2.6 对寄主行为的影响 |
| 5 寄生蜂的人工繁殖 |
| 5.1 替代寄主 |
| 5.2 补充营养 |
| 5.3 低温贮藏 |
| 5.4 滞育调控 |
| 5.5 其他因素 |
| 6 生物防治技术与策略 |
| 6.1 寄生蜂的人工释放 |
| 6.1.1 单种天敌释放 |
| 6.1.2 多种天敌联合释放 |
| 6.2 寄生蜂的保护和助增 |
| 6.2.1 作物间作 |
| 6.2.2 种植蜜源植物 |
| 6.2.3 植物支持系统和生态调控 |
| 7 总结和展望 |
（5）烟芽夜蛾囊泡病毒3h株对甜菜夜蛾几丁质酶活性和表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 甜菜夜蛾及其发生与危害的简介 |
| 1.2 烟芽夜蛾囊泡病毒3h株的简介 |
| 1.3 昆虫几丁质酶 |
| 1.3.1 昆虫几丁质酶的性质 |
| 1.3.2 昆虫几丁质酶的分类 |
| 1.3.3 昆虫几丁质酶的功能 |
| 1.3.4 昆虫几丁质酶体内转录、表达的研究 |
| 1.3.5 昆虫几丁质酶体外表达的研究 |
| 1.4 几丁质酶代谢紊乱对昆虫的影响 |
| 1.5 本论文的研究目的、意义及技术路线 |
| 1.5.1 研究目的 |
| 1.5.2 研究意义 |
| 1.5.3 主要研究内容及技术路线 |
| 第2章 甜菜夜蛾几丁质酶基因的克隆与系统发育分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料方法 |
| 2.2.1 试剂及仪器 |
| 2.2.2 甜菜夜蛾的饲养及样品获取 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 总RNA提取及c DNA合成 |
| 2.2.5 目的片段的扩增与纯化 |
| 2.2.6 蛋白序列和结构分析 |
| 2.2.7 系统发育分析 |
| 2.2.8 技术路线 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 基因的克隆及测序 |
| 2.3.2 蛋白二级结构分析 |
| 2.3.3 蛋白三级结构分析 |
| 2.3.4 甜菜夜蛾几丁质酶的系统发育分析 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第3章 甜菜夜蛾几丁质酶的原核表达及其多克隆抗体的制备 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料方法 |
| 3.2.1 试剂及仪器 |
| 3.2.2 引物设计 |
| 3.2.3 目的片段的扩增与纯化 |
| 3.2.4 原核表达载体的构建及鉴定 |
| 3.2.5 酶蛋白的外源表达及纯化 |
| 3.2.6 多克隆抗体的制备 |
| 3.2.7 多克隆抗体的检测(Western blot) |
| 3.2.8 体外表达几丁质酶活性的测定 |
| 3.2.9 数据处理 |
| 3.2.10 技术路线 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 基因的克隆及测序 |
| 3.3.2 重组表达载体的鉴定 |
| 3.3.3 蛋白的少量表达 |
| 3.3.4 蛋白的表达及纯化 |
| 3.3.5 抗体的检测 |
| 3.3.6 SeCHIT体外活性的测定 |
| 3.3.7 SeCBD对 SeCHIT的活性的影响 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第4章 HvAV-3h对甜菜夜蛾几丁质酶活性的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料方法 |
| 4.2.1 试剂及仪器 |
| 4.2.2 供试昆虫的饲养及HvAV-3h的扩繁 |
| 4.2.3 病毒的接种和实验样品的获取 |
| 4.2.4 几丁质酶活性的测定 |
| 4.2.5 数据处理 |
| 4.2.6 技术路线 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 几丁质酶活性随甜菜夜蛾生长发育的变化 |
| 4.3.2 几丁质酶活性的组织特异性 |
| 4.3.3 HvAV-3h对不同感染时间几丁质酶活性的影响 |
| 4.3.4 HvAV-3h对不同组织中几丁质酶活性的影响 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第5章 HvAV-3h对甜菜夜蛾几丁质酶转录、表达的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料方法 |
| 5.2.1 试剂及仪器 |
| 5.2.2 昆虫饲养、病毒接种及样品获取 |
| 5.2.3 引物设计 |
| 5.2.4 总RNA提取和c DNA合成 |
| 5.2.5 实时荧光定量PCR和半定量PCR |
| 5.2.6 甜菜夜蛾虫体蛋白的提取及Western blot检测 |
| 5.2.7 数据处理 |
| 5.2.8 技术路线 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 SeCHIT在不同生长发育阶段转录水平的检测 |
| 5.3.2 SeCHIT转录的组织特异性检测 |
| 5.3.3 HvAV-3h对 SeCHIT转录、表达时相的影响 |
| 5.3.4 HvAV-3h对 SeCHIT在各组织中转录水平的影响 |
| 5.3.5 HvAV-3h对 SeCBD转录、表达的影响 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第6章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 本文所用分子克隆方法 |
| 附录2 本文所用溶液及试剂配方 |
| 附录3 本文附图 |
| 附录4 本文附表 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）可用作生物杀虫剂的家蚕核型多角体病毒orf65、orf91的基因功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 图表清单 |
| 缩略词 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 家蚕、杆状病毒与食品 |
| 1.1.1 家蚕与食品的关系 |
| 1.1.2 杀虫剂与食品安全 |
| 1.1.3 杆状病毒杀虫剂与食品安全 |
| 1.1.4 重组杆状病毒杀虫剂 |
| 1.2 杆状病毒概况 |
| 1.2.1 杆状病毒分类及生活周期 |
| 1.2.2 杆状病毒与宿主的相互作用 |
| 1.2.3 杆状病毒宿主范围 |
| 1.2.4 杆状病毒的应用 |
| 1.3 家蚕核刑多角体病毒 |
| 1.3.1 家蚕核型多角体病毒简介 |
| 1.3.2 家蚕核型多角体病毒的多样性 |
| 1.3.3 AcMNPV与BmNPV的基因组比较 |
| 1.3.4 BmNPV基因的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 1.4.1 主要研究内容 |
| 1.4.2 研究的技术路线 |
| 2 Bm65基因生物信息学分析 |
| 2.1 分析软件及方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 Bm65的核苷酸及氨基酸的序列特征 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 Bm65的原核表达、真核表达及多克隆抗体制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌种、载体、实验动物 |
| 3.1.2 酶和化学试剂 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 缓冲液 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物设计及PCR |
| 3.2.2 CaCl_2法制备大肠杆菌感受态细胞 |
| 3.2.3 目的蛋白的诱导表达 |
| 3.2.4 目的蛋白的割胶纯化 |
| 3.2.5 抗血清的制备 |
| 3.2.6 SDS-PAGE及免疫印迹分析 |
| 3.2.7 pAc~(Bm65-egfp)的构建 |
| 3.2.8 细胞转染 |
| 3.2.9 转染上清感染sf9细胞 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Bm65的克隆 |
| 3.3.2 Bm65基因的原核表达及检测 |
| 3.3.3 融合蛋白的鉴定 |
| 3.3.4 Bm65蛋白多克隆抗体的制备及检测 |
| 3.3.5 Bm65真核表达基因的克隆 |
| 3.3.6 HTB-ie1-egfp-Bm65z-SV40的构建及鉴定 |
| 3.3.7 pAc~(Bm65-egfp) bacmid的构建及鉴定 |
| 3.3.8 pAc~(Bm65-egfp)转染sf9细胞 |
| 3.3.9 免疫印迹检测Bm65的表达情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 Bm65在BmN细胞中的转录分析和蛋白定位 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒、细胞和试剂 |
| 4.1.2 引物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 总RNA的提取 |
| 4.2.2 RT-PCR |
| 4.2.3 5’-RACE分析 |
| 4.2.4 免疫荧光观察 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 Bm65的转录分析 |
| 4.3.2 Bm65的表达时相 |
| 4.3.3 Bm65的亚细胞定位 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 Bm65缺失型病毒的构建及功能分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 质粒、菌株、试剂 |
| 5.1.2 引物 |
| 5.1.3 抗生素配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 Bm65基因打靶线性化片段的制备 |
| 5.2.2 电转化感受态DH10Bac细胞制备 |
| 5.2.3 电击转化同源重组 |
| 5.2.4 含有pBm~(Bm65KO)的菌株中pBAD-gbaA质粒的去除 |
| 5.2.5 供体质粒pFB1-polh-gfp-Bm65的构建 |
| 5.2.6 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm65KO-GP)和pBm~(Bm65Rep-GP)的构建 |
| 5.2.7 细胞转染 |
| 5.2.8 转染上清感染BmN细胞 |
| 5.2.9 病毒滴度测定 |
| 5.2.10 qPCR分析Bm65缺失后对病毒DNA复制的影响 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 Bm65基因打靶线性化片断的鉴定 |
| 5.3.2 重组质粒pUC18-Bm65US-Cm-Bm65DS的酶切鉴定 |
| 5.3.3 Bm65缺失型病毒的构建及鉴定 |
| 5.3.4 pFB1-polh-gfp-Bm65的构建及鉴定 |
| 5.3.5 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm65KO-GP)和pBm~(Bm65Rep-GP)的构建及鉴定 |
| 5.3.6 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm65KO-GP)和pBm~(Bm65Rep-GP)在BmN细胞上的复制分析 |
| 5.3.7 病毒DNA复制分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 Bm91基因生物信息学分析 |
| 6.1 分析软件及方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 Bm91的核苷酸和其编码的氨基酸的序列特征 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 7 Bm91的多克隆抗体制备、转录分析及蛋白定位 |
| 7.1 材料 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 BV的纯化 |
| 7.2.2 多角体的纯化 |
| 7.2.3 ODV的纯化 |
| 7.2.4 BV/ODV囊膜蛋白的分离纯化 |
| 7.2.5 BV/ODV核衣壳的分离纯化 |
| 7.2.6 N-糖基化抑制实验 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 Bm91的克隆 |
| 7.3.2 Bm91基因的原核表达及检测 |
| 7.3.3 融合蛋白的鉴定 |
| 7.3.4 Bm91蛋白的多克隆抗体制备及抗体的检测 |
| 7.3.5 Bm91的转录分析 |
| 7.3.6 Bm91的表达时相 |
| 7.3.7 Bm91的亚细胞定位 |
| 7.3.8 Bm91蛋白在病毒结构中的定位 |
| 7.3.9 N-糖基化抑制实验 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 8 Bm91缺失型病毒的构建及功能分析 |
| 8.1 材料 |
| 8.2 方法 |
| 8.2.1 重组质粒pUC18-Bm91US-Cm-Bm91DS的构建 |
| 8.2.2 重组病毒半数致死剂量(50% lethal dose,LD_(50))的测定 |
| 8.2.3 重组病毒半数致死时间(50% lethal time,LT_(50))的测定 |
| 8.3 结果 |
| 8.3.1 Bm91基因打靶线性化片段的PCR扩增 |
| 8.3.2 重组质粒pUC18-Bm91US-Cm-Bm91DS的酶切鉴定 |
| 8.3.3 Bm91缺失型病毒的构建及鉴定 |
| 8.3.4 pFB1-polh-gfp-Bm91的构建及鉴定 |
| 8.3.5 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm91KO-GP)和pBm~(Bm91Rep-GP)的构建及鉴定 |
| 8.3.6 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm91KO-GP)和pBm~(Bm91Rep-GP)在RmN细胞上的复制 |
| 8.3.7 Bm91缺失病毒的生物学分析 |
| 8.4 讨论 |
| 8.5 小结 |
| 9 总结和展望 |
| 9.1 总结 |
| 9.2 展望 |
| 9.2.1 Bm65的进一步分析 |
| 9.2.2 Bm91的进一步分析 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的研究论文和参加的课题 |
| 发表的研究论文 |
| 导师指导下主持课题 |
| 参与课题 |
（7）斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型（SpltMNPV Ⅱ）BV、ODV组成型蛋白质谱分析和4种ORF的基因分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1、杆状病毒的生活史 |
| 2、杆状病毒的基因组 |
| 3、杆状病毒的基因结构 |
| 4. 保守基因及其功能 |
| 5. 可变基因 |
| 6. 基因组的重组 |
| 7. 杆状病毒表达系统 |
| 第二章 研究目的与研究内容 |
| 1、研究目的 |
| 2、研究内容 |
| 3、技术路线 |
| 第三章 主要试剂与常用实验方法 |
| 1、常用试剂 |
| 2、常用试验方法 |
| 第四章 SpltMNPVⅡBVs和ODVs组成型蛋白质谱分析 |
| 1、材料和方法 |
| 2、实验结果与分析 |
| 3、讨论 |
| 第五章 SpltMNPVⅡ ORF6、ORF13、ORF57 和ORF146 基因结构分析 |
| 1、材料和方法 |
| 2、实验结果与分析 |
| 3、讨论 |
| 第六章 SpltMNPVⅡ ORF6、ORF13、ORF57 和 ORF146 基因启动子活性和转录时相分析 |
| 1、材料和方法 |
| 2、实验结果与分析 |
| 3、讨论 |
| 第七章 SpltMNPVⅡ ORF6、ORF13、ORF57 和 ORF146 基因的原核表达和抗体制备 |
| 1、材料与方法 |
| 2、实验结果与分析 |
| 3、讨论 |
| 第八章 SpltMNPVⅡ ORF6、ORF13 和 ORF146 基因在宿主细胞中的表达时相 |
| 1、材料与方法 |
| 2、研究结果 |
| 3、讨论 |
| 第九章 SpltMNPVⅡ ORF57 基因的功能鉴定 |
| 1、材料和方法 |
| 2、实验结果与分析 |
| 3、讨论 |
| 第十章 结论与创新点 |
| 1、结论 |
| 2、创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表和待发表的学术论文 |
| 攻读学位期间参与的科研项目 |
| 英文缩略表 |
| 致谢 |
（8）家蚕核型多角体病毒（BmNPV）Bm5的基因分析及利用基因芯片筛选抗BmNPV相关基因（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒概述 |
| 1.1.1 杆状病毒的分类 |
| 1.1.2 杆状病毒的形态和结构 |
| 1.1.3 杆状病毒的生活周期 |
| 1.1.4 杆状病毒基因组研究进展 |
| 1.2 昆虫和杆状病毒的相互关系 |
| 1.2.1 昆虫抗病毒研究 |
| 1.2.2 对病毒的遗传抗性 |
| 1.2.3 对病毒感染的物理和生理屏障 |
| 1.2.4 细胞免疫 |
| 1.2.5 细胞凋亡 |
| 1.2.6 体液免疫 |
| 1.3 家蚕抗NPV的研究 |
| 1.3.1 杆状病毒侵染昆虫的机理 |
| 1.3.2 BmNPV的增殖曲线及病毒增殖与蚕体生理代谢的变化 |
| 1.3.3 家蚕对BmNPV抵抗性的遗传规律研究 |
| 1.3.4 家蚕中肠在抗NPV的作用 |
| 1.3.5 家蚕抗BmNPV的相关基因 |
| 1.4 基因芯片研究进展及应用 |
| 1.4.1 芯片的发展及研究步骤 |
| 1.4.2 芯片分类 |
| 1.4.3 芯片的应用领域 |
| 1.4.4 基因芯片技术在家蚕中的应用 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 1.6 主要研究内容和研究路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 研究路线 |
| 第二章 Bm5基因序列分析、原核表达和多克隆抗体制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 Bm5的核苷酸和其编码的氨基酸的序列特征 |
| 2.2.2 BM5的氨基酸同源性分析 |
| 2.2.3 Bm5的克隆 |
| 2.2.4 Bm5基因的原核表达及检测 |
| 2.2.5 BM5蛋白的纯化 |
| 2.2.6 融合蛋白6×His接头的鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 Bm5基因的转录、表达研究及表达产物的定位 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Bm5的转录时相 |
| 3.2.2 Bm5的表达时相 |
| 3.2.3 BM5的亚细胞定位 |
| 3.2.4 BM5蛋白在病毒结构中的定位 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 家蚕核型多角体病毒Bm5的缺失和拯救 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 大肠杆菌菌株BW25113-Bac的获得 |
| 4.2.2 Bm5基因打靶线性化片断的鉴定 |
| 4.2.3 重组质粒pUC-US-Cm-DS的酶切鉴定 |
| 4.2.4 Bm5缺失重组Bacmid的构建和验证 |
| 4.2.5 vBm-wt、vBm5-ko和vBm5-re三种Bacmid的获得 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 基因芯片的筛选抗BmNPV相关基因 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 RNA提取的浓度和纯度鉴定 |
| 5.2.2 高密度家蚕Oligo芯片杂交结果 |
| 5.2.3 芯片的图像处理及数据采集结果 |
| 5.2.4 筛选差异基因 |
| 5.2.5 GO分析结果 |
| 5.2.6 Pathway分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 第六章 部分差异基因的验证 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 RT-PCR检测抗性相关基因 |
| 6.2.2 QRT-PCR检测相关抗性基因 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 实时相对定量荧光RT-PCR技术 |
| 6.3.2 验证材料的特异性 |
| 6.3.3 验证差异基因的时间、空间特异性 |
| 6.3.4 验证方法的特异性 |
| 6.3.5 鉴定的基因功能分析 |
| 6.4 结论 |
| 总结和展望 |
| 总结 |
| 展望 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表的研究论文和参加的课题 |
| 致谢 |
（9）棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒HaSNPV orf101的原核表达及抗体制备（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株、质粒和试剂 |
| 1.2 重组表达载体的构建 |
| 1.3 目的基因的诱导表达及SDS-PAGE凝胶分析 |
| 1.4 多克隆抗血清的制备 |
| 1.5 多克隆抗体的Western Blot鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Ha101的克隆及重组表达载体的酶切鉴定 |
| 2.2 目的蛋白的诱导表达及SDS-PAGE凝胶分析 |
| 2.3 多克隆抗血清的制备及Western Blot检测 |
| 3 讨论 |
（10）棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒（HaSNPV）orf44基因的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 杆状病毒简介 |
| 1.1 杆状病毒的分类 |
| 1.2 杆状病毒的结构 |
| 1.3 杆状病毒的生活史 |
| 1.4 杆状病毒的复制过程 |
| 2 杆状病毒的分子生物学特性 |
| 2.1 杆状病毒的基因组特征 |
| 2.2 杆状病毒的结构蛋白基因 |
| 2.3 杆状病毒基因的保守基因 |
| 3 杆状病毒功能基因组学研究的方法 |
| 3.1 基因的功能预测 |
| 3.2 通过基因表达产物的定位来获得基因的功能信息 |
| 3.3 利用基因突变分析研究杆状病毒基因的功能 |
| 3.4 基因的超量表达功能分析 |
| 4 杆状病毒的应用 |
| 4.1 杆状病毒作为载体表达系统 |
| 4.2 重组杆状病毒杀虫剂 |
| 4.3 杆状病毒与基因治疗 |
| 4.4 杆状病毒与表面展示 |
| 5 本实验的研究背景、目的和意义 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 本研究的目的及意义 |
| 第一章 HaSNPV orf44基因的克隆表达及抗体制备 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 酶、化学试剂和试剂盒 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 HaSNPV多角体的提取 |
| 2.2 HaSNPV基因组的提取 |
| 2.3 HaSNPV orf44基因的扩增、克隆与测序 |
| 2.4 HaSNPV orf44基因的亚克隆及阳性重组子的鉴定 |
| 2.5 电转化感受态细胞的制备 |
| 2.6 电转化、涂布及培养 |
| 2.7 大肠杆菌中质粒的提取方法 |
| 2.8 目的基因的原核表达及SDS-PAGE分析 |
| 2.9 原核表达蛋白质的纯化 |
| 2.10 orf44蛋白的抗血清制备 |
| 2.11 Western杂交 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 orf44基因的克隆及重组表达载体的酶切鉴定 |
| 3.2 重组表达载体的诱导表达和SDS-PAGE分析 |
| 3.3 orf44蛋白抗血清的制备及Western-blot检测 |
| 4 讨论 |
| 第二章 HaSNPV Ha44的亚细胞定位 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 酶、化学试剂和试剂盒 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 pIZ/V5-egfp重组载体的构建 |
| 2.2 pIZ/V5-egfp/orf44重组载体的构建 |
| 2.3 pIZ/V_5-egfp/orf44质粒的提取 |
| 2.4 细胞培养及质粒转染 |
| 2.5 转染后细胞表达观察 |
| 3 结果 |
| 3.1 pIZ/V5-egfp重组质粒的构建 |
| 3.2 pIZ/V5-egfp/orf44重组质粒的构建 |
| 3.3 荧光显微镜观察结果 |
| 2.4 激光扫描共聚焦显微镜观察结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 HaSNPV G4株orf44缺失重组病毒的构建 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 酶、化学试剂和试剂盒 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 含有50bp左右orf44同源臂的P_(hsp70)-Cm~r线性片段的获得 |
| 2.2 含有HaBacHZ8和λ噬菌体Red重组酶的感受态细胞的制备 |
| 2.3 orf44基因的缺失 |
| 2.4 大肠杆菌中Bacmid的提取法 |
| 2.5 重组子的鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 orf44基因缺失型重组病毒的构建 |
| 3.2 重组病毒的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、棉铃虫单核衣壳核多角体病毒3个bro基因的原核表达与抗体制备（论文参考文献）
- [1]F蛋白与SeNPC1在SeMNPV感染宿主吸附阶段及在对杆状病毒超感染排斥中的作用[D]. 安丽. 贵州师范大学, 2021(12)
- [2]热休克蛋白HSC70-4及其乙酰化修饰在家蚕杆状病毒侵染过程中的功能研究[D]. 毛赋翔. 浙江理工大学, 2020
- [3]昆虫保幼激素和核型多角体病毒膜受体的筛选[D]. 刘鹏飞. 河南大学, 2020(02)
- [4]中国寄生蜂研究及其在害虫生物防治中的应用[J]. 时敏,唐璞,王知知,黄健华,陈学新. 应用昆虫学报, 2020(03)
- [5]烟芽夜蛾囊泡病毒3h株对甜菜夜蛾几丁质酶活性和表达的影响[D]. 何磊. 湖南农业大学, 2019
- [6]可用作生物杀虫剂的家蚕核型多角体病毒orf65、orf91的基因功能分析[D]. 唐琦. 江苏大学, 2013(07)
- [7]斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型（SpltMNPV Ⅱ）BV、ODV组成型蛋白质谱分析和4种ORF的基因分析[D]. 盛晔. 苏州大学, 2010(06)
- [8]家蚕核型多角体病毒（BmNPV）Bm5的基因分析及利用基因芯片筛选抗BmNPV相关基因[D]. 周阳. 江苏大学, 2010(05)
- [9]棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒HaSNPV orf101的原核表达及抗体制备[J]. 李志远,邱小慧,周玥,钱丽莹,徐旭士. 安徽农业科学, 2008(35)
- [10]棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒（HaSNPV）orf44基因的研究[D]. 周玥. 南京师范大学, 2007(04)