一、HPV6b L1蛋白在昆虫细胞中的表达及其作为特异性诊断抗原的初步研究（论文文献综述）
麻粉莲[1]（2013）在《JY佐剂对人乳头瘤病毒（HPV）和乙肝病毒表面抗原（HBsAg）疫苗黏膜免疫研究》文中指出人乳头瘤病毒（human papillomaviruses, HPVs）晚期蛋白1（L1）是疫苗研究的主要靶抗原。目前上市的HPV疫苗有葛兰素公司用昆虫细胞生产的HPV16、18型二价L1VLP疫苗（Cervarix）和默克公司用酿酒酵母生产的HPV6、11、16、18型四价L1VLP疫苗（Gardasil）,在9-26岁年轻女性中使用,预防宫颈癌。但上述疫苗存在以下问题：价格昂贵,肌肉注射依从性差,在发展中国家使用受到限制；与宫颈癌密切相关的HPV型别较多,国外研制的疫苗只能预防两种高危型HPV型别引起的宫颈上皮内瘤变（CIN）,因为仅抑制两种高危HPVs,其它高危HPVs有可能乘机可在宫颈繁殖,引起宫颈癌。因此,研发抗原谱广、价格低廉、使用方便的新型HPV疫苗具有重要意义。虽然乙肝疫苗的预防效果比较显着,但我国仍是乙肝高发地区。目前单独应用基因工程HBsAg免疫原性较低,需要联合佐剂才能使机体产生保护性的免疫应答,但铝佐剂乙肝疫苗诱导的细胞免疫较弱,有10%左右的人群呈无应答或低应答,并且乙肝疫苗接种次数较多,疼痛感明显,接种依从性差。因此,研究开发新型乙肝疫苗十分重要。研究表明,黏膜疫苗具有以下优点：给药途径简便,接种依从性高；可产生细胞免疫；鼻腔免疫可诱导阴道局部抗体；反复黏膜免疫可拓宽抗原保护谱；无需使用针头及注射器等潜在感染源。2007年,我国病毒生物技术国家工程研究中心北京金迪克研究所将壳聚糖与细胞因子IL-2组成复方,研发新型JY佐剂系统,以期提高疫苗免疫效果。本研究旨在探讨JY佐剂对HPV16、18L1VLP黏膜免疫效果的影响,并观察反复鼻腔免疫后与HPV58、11和6型的免疫交叉反应,以期开发新型HPV黏膜疫苗。此外,本研究亦开展了不同剂量的IL-2和壳聚糖佐剂对小鼠乙肝疫苗免疫应答的影响,及注射免疫后用粘膜免疫来加强乙肝抗体的研究。主要研究内容和结果如下：1.HPV16、18型L1病毒样颗粒（virus-like particle, VLP）黏膜免疫研究用含或不含JY佐剂的HPV16、18L1VLP分别肌肉、阴道和鼻腔免疫BALB/c小鼠,于第0、3、6周各免疫1次,免疫后第2、5、8周采血,检测血清IgG抗体滴度；于第8周分离脾淋巴细胞并收集呼吸道灌洗液,检测细胞免疫和黏膜免疫效果。鼻腔免疫各组取5只小鼠,继续免疫10次,收集第14、20、26、32和38周的血清,检测HPV16、18L1蛋白免疫血清与HPV58、11和6型交叉免疫反应。1.1HPV16、18型L1VLP体液免疫效果免疫三次后,HPV16、18L1VLP经鼻腔、阴道和肌肉注射免疫均能产生特异性体液免疫反应。HPV16、18L1VLP经鼻腔免疫的IgG抗体水平低于经肌肉免疫,但高于阴道免疫,但含有JY佐剂的HPV16和18型L1VLP鼻腔免疫七次后IgG抗体水平达到其肌肉注射第三次的水平（1：20480）。另外,含有JY佐剂的HPV16、18L1VLP肌肉注射、鼻腔和阴道免疫组血清特异性IgG水平均高于不含JY佐剂的免疫组,表明JY佐剂能够提高HPV16、18L1VLP免疫后血清IgG抗体水平。1.2HPV16、18型L1VLP黏膜免疫效果免疫3次后,肌肉注射免疫组未检测至sIgA抗体,但鼻腔和阴道免疫组检测到sIgA抗体。具体结果如下：1.2.1鼻腔免疫组的黏膜免疫效果鼻腔免疫后,HPV16L1、HPV16L1+JY、HPV18LI、HPV18L1+JY、HPV16和18型L1联合免疫、HPV16和18型L1+JY联合免疫组的呼吸道灌洗液sIgA浓度分别为22.11、27.26、23.47、30.06、23.85和26.54μg/mL,与阴性对照组之间差异均有统计学意义（P<0.01）。含有JY佐剂L1蛋白免疫组sIgA浓度高于不含佐剂组,差异有统计学意义（P<0.05）,表明JY佐剂可提高HPV16、18型L1VLP鼻腔黏膜免疫效果。1.2.2阴道免疫组的黏膜免疫效果阴道免疫后,HPV16L1、HPV16L1加上JY佐剂、HPV18L1、HPV18L1加上JY佐剂、HPV16和HPV18型L1联合免疫、HPV16和HPV18型L1加上JY佐剂的联合免疫组的呼吸道灌洗液sIgA浓度分别为25.07、31.99、18.64、23.28、19.65和29.34μg/mL,与阴性对照组之间的差异均有统计学意义（P<0.01）。含有JY佐剂L1蛋白免疫组sIgA浓度高于不含佐剂组,且差异有统计学意义（P<.05）,表明JY佐剂增强HPV16、18L1VLP阴道黏膜免疫效果。1.3HPV16、18型L1VLP细胞免疫效果免疫3次后,在鼻腔免疫和肌肉注射免疫组检测到细胞免疫反应,但在阴道免疫组未检测到。具体结果如下：1.3.1鼻腔免疫组的细胞免疫效果用HPV16L1VLP刺激小鼠脾淋巴细胞,HPV16L1、HPV16L1+JY、 HPV16/18L1联合免疫、HPV16/18L1+JY联合免疫组细胞斑点数分别为91±5.25、176.8±55.75、93.6±13.01和180.2±31.39。当用HPV18L1VLP刺激小鼠脾淋巴细胞后,HPV18L1、HPV18L1+JY、HPV16/18L联合免疫、HPV16/18L1+JY联合免疫组细胞斑点数分别为90±4.95、132.2.8±11.43、109.8.6±10.18和249.8±51.51。HPV16或18型L1VLP免疫诱导的斑点数均高于PBS对照组（41.3±11.24）,且差异均有统计学意义（P<0.01）。含有JY佐剂组Ll蛋白免疫组高于不含佐剂免疫组,且差异有统计学意义（P<0.01）。表明JY佐剂提高HPV16、18L1VLP经鼻腔免疫诱导细胞免疫应答。1.3.2肌肉注射免疫组的细胞免疫效果用HPV16L1VLP刺激小鼠脾淋巴细胞后,HPV16L1、HPV16L1+JY、 HPV16/18L1联合免疫、HPV16/18L1+JY联合免疫组的细胞斑点数分别为75.67±10.41、80.33±12.7、74.41±13.61和94.33±33.26。当用HPV18L1VLP刺激小鼠脾淋巴细胞后,HPV18L1、HPV18L1+JY、HPV16/18L1联合免疫、HPV16/18L1+JY佐剂的联合免疫组的细胞斑点数分别为68±15.87、90.67±3.51、83.33±29.74和100±13.75。用HPV16或18型L1蛋白诱导的斑点数均高于阴性对照组（42.5±13.12）,且差异均有统计学意义（P<0.05）。含有JY佐剂的L1VLP免疫组高于不含佐剂免疫组,表明JY佐剂加强HPV16、18L1VLP经肌肉免疫诱导的细胞免疫应答。1.4HPV16、18L1VLP中和抗体检测通过HPV16L1假病毒,检测到含有JY佐剂的HPV16和18L1联合鼻腔免疫后血清中和抗体滴度为1：100,其阴道免疫时血清中和抗体滴度为1：50,而不含JY佐剂组未检测到。含有和不含有JY佐剂的HPV16和18型L1VLP联合肌肉注射免疫诱导的血清中和抗体滴度分别为1：6400和1：200,表明JY佐剂诱导鼻腔和阴道免疫产生中和抗体,并提高肌肉注射免疫的中和抗体滴度。1.5HPV16、18L1VLP反复鼻腔免疫后血清抗体的交叉反应HPV16、18L1VLP与HPV58、11和6型之间均有免疫交叉反应,且在第32周血清特异性IgG抗体滴度最高。在第32周,HPV58型与16、18型之间IgG滴度分别高达1：131072、11：16384；HPV6型与16、18型之间IgG滴度均高达1：8192；HPV11型与16、18型之间IgG滴度分别高达1：16384、1：8192,表明HPV16、18型L1蛋白与HPV58型之间的抗体交叉反应较强,与HPV11、6型的免疫交叉反应较弱。经核苷酸序列比对发现,HPV58型L1与HPV16、18型L1基因序列的同源性分别为76%和70%；而HPV11、6型与HPV18、16的同源性为66-69%；因此,HPV16和18型L1VLP与HPV58型的抗体交叉保护作用较强,与HPV11和6型的抗体交叉保护作用稍弱。研究表明,抗原反复鼻腔免疫可扩大抗原表位识别范围,对非表位决定簇产生反应,从而对其他型别病毒提供广谱免疫保护,这与本研究所得结论一致。综上,HPV16、18L1蛋白经过反复鼻腔免疫可以拓宽抗原保护谱。JY佐剂增强HPV16、18L1VLP鼻腔免疫诱导的体液免疫、细胞免疫和黏膜抗体应答,亦能增强阴道免疫诱导的体液和黏膜免疫效,和肌肉注射免疫诱导的细胞和体液免疫反应,表明JY佐剂可成为一种有效的佐剂。2.JY佐剂对乙肝病毒表面抗原（HBsAg）疫苗黏膜免疫研究将不同剂量IL-2和壳聚糖组成的JY佐剂用于乙肝表面抗原HBsAg,经检测鼻腔免疫小鼠血清IgG抗体滴度发现,20000IU IL-2/只小鼠和0.025%壳聚糖用于HBsAg抗原时,血清抗体水平最高。此外,含铝佐剂乙肝疫苗注射免疫后用含JY佐剂乙肝疫苗进行粘膜加强免疫的研究表明,0.5ug或2μg含铝佐剂乙肝疫苗肌肉注射初免或免疫两次后,8μg和4μg含JY佐剂乙肝疫苗鼻腔加强免疫代替其第2次或第3次含铝佐剂乙肝疫苗肌肉注射免疫。2μg含铝佐剂乙肝疫苗肌肉注射初免或免疫两次后,第2次或第3次铝佐剂肌肉注射加强免疫组诱导的抗体水平与8μg和4μg含JY佐剂乙肝疫苗鼻腔加强免疫所诱导的抗体水平相当。0.5μg含铝佐剂乙肝疫苗肌肉注射初免或免疫两次后,用0.5μg铝佐剂乙肝疫苗肌肉注射加强免疫诱导的血清抗体水平与含JY佐剂疫苗鼻腔加强免疫的抗体水平均相当。JY是一种安全有效佐剂,可用于提高乙肝病毒疫苗黏膜免疫诱导的血清抗体水平。
石朝辉,朱珊丽,许文,陆丽君,李玲玲,张丽芳[2]（2010）在《HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合DNA诱导BALB/c小鼠产生特异性细胞免疫的研究》文中认为目的探讨人乳头瘤病毒（HPV）6b结构蛋白L1和沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）多表位嵌合DNA（HPV6b L1/Ct MOMP）诱导BALB/c小鼠产生特异性细胞免疫效应,及HPV6b L1对Ct MOMP多表位基因诱导细胞免疫的增强作用。方法将Ct MOMP多表位基因连接在经真核密码子优化的HPV6b L1羧基端,构建嵌合重组质粒pcDNA3.1（+）/HPV6b L1/Ct MOMP多表位,经酶切和测序证实后,转染COS-7细胞,间接免疫荧光鉴定其在真核细胞中的表达;将纯化后的嵌合重组质粒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,并设置pcDNA3.1（+）/Ct MOMP多表位质粒、pcDNA3.1（+）和PBS三组对照。采用0、2、4周免疫程序,DNA剂量为每只150μg/次。于末次免疫后2周,分别用乳酸脱氢酶（LDH）释放法和细胞内细胞因子染色-流式细胞术（ICS-FACS）检测小鼠脾细胞对Ct MOMP多表位蛋白和HPV6b L1蛋白的特异性CTL活性,胞内细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10产生水平等细胞免疫应答指标。结果免疫后,在效靶比（E:T）分别为40:1、20:1时,pcDNA3.1（+）/HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合重组质粒免疫组小鼠产生了针对Ct MOMP多表位蛋白特异性CTL杀伤活性（44.56%±4.02%,35.35%±2.89%）和HPV6b L1蛋白特异性CTL杀伤活性（27.08%±2.04%,21.68%±4.06%）,与各对照组比较差异有统计学意义（F=72.87,F=114.55,P<0.05;F=30.04,F=10.47,P<0.05）,且显着高于pcDNA3.1（+）/Ct MOMP多表位质粒组（35.50%±2.68%,30.24%±1.75%;12.27%±3.36%,9.32%±3.07%;P<0.05）;而pcDNA3.1（+）/Ct MOMP多表位质粒组小鼠仅显示了Ct MOMP多表位特异性的CTL杀伤活性,与对照组比较差异也有统计学意义（F=58.85,F=120.21;P<0.05）。胞内细胞因子IFN-γ的产生水平,pcDNA3.1（+）/HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合质粒组（4.34%±0.06%）高于pcDNA3.1（+）/CtMOMP多表位质粒组（3.14%±0.18%）,与对照组比较差异有统计学意义（F=473.83,P<0.05）,而重组质粒组较空载体组和PBS对照组差异也有统计学意义（F=211.72,P<0.05）;但IL-4和IL-10水平则各组间差异无统计学意义（F=0.97,P>0.05;F=2.25,P>0.05）。结论 pcDNA3.1（+）/HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合DNA质粒可诱导BALB/c小鼠同时产生针对HPV6b L1蛋白和Ct MOMP多表位蛋白特异性的细胞免疫效应;真核密码子优化的HPV6b L1能显着增强Ct MOMP多表位基因诱导的小鼠特异性细胞免疫效应。
谢毅[3]（2010）在《短发卡状RNA抑制AKT2基因治疗肝癌的实验研究》文中研究表明原发性肝癌是常见的消化系统恶性肿瘤,约占消化系统肿瘤的20%以上,其中肝细胞肝癌约占90%,其生物学特征为易复发、转移、预后差、死亡率高。尽管目前原发性肝癌的治疗方案（手术切除、介入治疗、生物治疗、激光及微波治疗等）日趋完善,但仍难以取得令人满意的疗效,患者生存期极短。因此研究肝癌的发病机理以及探讨新的可行的治疗方案具有极其重要的临庆意义。随着肿瘤学领域中基础研究的不断深入,近年来信号传导通路在肿瘤发生过程中的异常改变及其导致细胞生长失控的机制成为研究的热点。研究发现磷脂酞肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号传导通路在肿瘤的发生、发展、凋亡、血管生成、转移及耐药等方面起着重要的作用。而AKT2作为PI3K/ AKT2信号转导通路的关键分子,在其中更是起着核心的作用。而多种人类恶性肿瘤主要表达AKT家族中的AKT2。细胞内高表达AKT2或激活AKT2的蛋白激酶活性能阻止细胞发生凋亡,增强肿瘤细胞的侵袭能力。目前,国内针对AKT2基因表达与肝细胞癌分化程度、生长方式、临床特点及转移活性的关系尚未进行深入系统的研究。针对AKT2利用小干扰RNA基因治疗肝癌尚无报道。本课题从三个角度进行了系统研究:①肝癌组织AKT2基因表达与肝癌恶性程度、临床特点、转移活性的相关性和在肝癌细胞中的表达。②采用脂质体体外转染针对AKT2的小干扰RNA,并建立稳定株观察转染后肿瘤细胞在体外的生长情况及产生的可能机制。③AKT2小干扰RNA转染后肿瘤细胞体内生长情况观察。结果将为探讨以AKT2为靶点并结合小干扰RNA进行基因治疗,阻止肿瘤的发生和发展,提高生存率,延长生存期奠定理论基础。第一部分AKT2在肝癌组织、肝癌细胞系中的表达及意义本研究对32对肝细胞癌（HCC）,4例正常肝组织、4株肝癌细胞株用RT-PCR反应、免疫组化法分别检测AKT2mRNA表达和蛋白表达的情况;分析肝癌AKT2基因表达与肿瘤分期、转移等临床指标之间的关系。1通过RT-PCR方法检测32对人肝细胞癌、4例正常肝脏组织AKT2mRNA表达水平:发现肝癌组织AKT2mRNA的表达明显高于癌旁组织,其中有28对上调,所占比率高达62.5%（P<0.05）。其中4对接近有和无的关系。正常肝中没表达。此外发现:瘤栓组AKT2mRNA表达水平为0.59±0.01,无瘤栓组为0.29±0.02;肝内转移组AKT2mRNA表达水平为0.62±0.03,无肝内转移组为0.30±0.02,相应的两组之间有显着差异。此结果表明AKT2mRNA表达水平增高与临床上肿瘤的侵袭特性有关。2采用免疫组化法检测AKT2蛋白在32例标本中的表达发现在62.5%（28/32例）的肝癌组织内可见到AKT2阳性表达,AKT2阳性表达颗粒主要位于胞膜和胞浆,在同一组织标本中AKT2表达呈现均一性。AKT2的表达在不同分化程度的肝癌有显着差异（P<0.05）,高分化肝癌的表达率和表达强度显着低于中分化、低分化肝癌。在肿瘤大小、肝内转移阳性组和阴性组、有和无门静脉癌栓组、HBsAg阳性组和阴性组间有显着性差异（P<0.05）。而与患者的年龄、性别无显着相关性（P>0.05）。3利用Western-blot技术检测AKT2基因在4株肝癌细胞株中的表达,发现肝癌细胞株SMMC-7721AKT2的表达最明显。由此可见,AKT2在肝癌的发生、发展和转移中发挥重要作用,抑制AKT2基因的表达将起到控制肿瘤生长的目的。第二部分封闭人肝癌AKT2的siRNA片段设计、筛选、真核表达载体的构建及SMMC7721细胞转染条件的优化1在哺乳动物细胞的siRNA研究中,有两个关键的步骤,即如何筛选出最有效的针对目标基因的siRNA片段,并使其高效转染入哺乳动物细胞内和表达。本实验通过网上的siRNA设计软件,设计针对AKT2的特异性siRNA。2质粒的扩增、提取及鉴定:采用DH5α大肠杆菌为工作菌,制备感受态细胞,扩增质粒,提取质粒DNA,并经酶切鉴定以备转染使用。3转染效率与脂质体的量和质粒量存在交互作用。在6孔板中以Lipofectamine2000 10μl,质粒量4.0ug时转染效率最高,达到85%以上。Lipofectamine2000转染中可以看到随着转染时间的延长,细胞毒性加大,大于8小时后,转染效率并没有增加。最大的转染效率和最小的细胞毒性的平衡点在8小时。4瞬时转染1,2,3,4,5,6天各组细胞的AKT2的mRNA的变化RT-PCR显示,第3天的时候达到高峰,AKT2的mRNA明显减少,而阴性对照组、空白组AKT2的mRNA没有明显变化。Western-blot检测提示,随着时间的延长,AKT2蛋白在第4天达到被封闭的高峰,而阴性对照组、空白组AKT2的蛋白的变化无显着的差异。研究结果提示:采用脂质体Lipofectamine2000可以成功的将AKT2-siRNA转入SMMC7721细胞中,使后者AKT2mRNA及蛋白的表达受到抑制为进一步观察肿瘤细胞的生物学变化打下基础。第三部分AKT2-siRNA对SMMC7721细胞生物学的影响鉴于第一部分结果显示AKT2在肝癌组织中呈过度表达现象,并且与肿瘤恶性程度、转移能力呈正相关。所以,以AKT2基因为优选靶,采用小干扰RNA技术,抑制AKT2基因表达,将会减少肝癌恶性表型,为肝癌的治疗带来希望。1利用高表AKT2mRNA及蛋白的肝癌细胞系（简称7721细胞）为体外细胞系模型,建立分别含有Supersilencing-AKT2-siRNA、GFP质粒的稳定细胞株。应用MTT法检测细胞生长曲线发现Supersilencing-AKT2-siRNA细胞的生长明显缓慢。应用流式细胞仪检测细胞的细胞周期,发现干扰组S期细胞百分率明显低于对照组（P<0.05）,而G0/G1期细胞百分率则明显高于对照组（P<0.05）。Western-blot结果提示干扰组CyclinD1、P27、P21的表达明显低于对照组（P<0.05）。以上说明抑制AKT2基因的表达能够明显降低肝癌细胞的增殖。2利用粘附实验发现干扰组细胞的粘附能力明显下降。通过计算2小时后粘附在平皿上的细胞OD值,我们可以看出,干扰组粘附能力下降约3倍左右。划线实验和Transwell实验都提示干扰组细胞的的侵袭能力明显下降了。明胶酶法检测细胞株MMP-2、MMP-9的结果,可以看到封闭AKT2的表达明显抑制了肝癌细胞MMP-2、MMP-9的表达。从Western-blot可以看到干扰组、LNR、ICAM-Ⅰ在蛋白水平的变化的表达明显低于对照组, E-cadherin在蛋白水平变化明显高于对照组（P<0.05）。研究结果提示:通过靶向阻断AKT2蛋白的表达可以抑制SMMC7721癌细胞株的生长和转移。第四部分封闭AKT2蛋白表达促人肝癌细胞凋亡作用实验研究AKT2的表达与肿瘤的凋亡抑制密切相关,这决定了AKT2在肝癌的靶向治疗上可能具有独特的价值。为了进一步探讨靶向抑制AKT2在肝细胞癌治疗中的意义和价值,我们观察其对肝癌细胞凋亡和化疗药物敏感性的影响。1在CHX（放线菌酮）诱导凋亡后,显微镜下可以观察到干扰组细胞较对照组细胞形态变化明显,表现为细胞间隙逐渐加大,部分细胞边缘变钝;贴壁性能差;易于脱落;死亡细胞较多见。应用DAPI染色显示实验组细胞凋亡明显增加,差异有显着性（P<0.05）。用流式细胞仪检测细胞凋亡,发现CHX处理24小时后可不同程度地诱导三组细胞凋亡,干扰组细胞凋亡数（34.2±4.4%）明显高于各对照组,（16.7±1.8%）,（20.4±2.1%）（P<0.05）。而对照组间比较无显着性差异（P>0.05）。本结果表明,AKT2-shRNA可抑制肿瘤细胞生长,增强肿瘤细胞对凋亡药物的敏感性。2在蛋白水平上,CHX诱导凋亡后,干扰组Bax蛋白,Caspase3蛋白表达比对照组明显上调,而Bcl-2蛋白表达明显下降。3用等浓度化疗药物吉西他滨处理发现干扰组细胞生长抑制率明显高于对照组细胞,组间差异有显着性（P<0.05）。由此我可以得出结论AKT2-shRNA可以增加肝癌细胞的凋亡易感性,为进一步的体内实验打下基础。第五部分AKT2小干扰RNA对肝癌细胞体内生长的影响为了进一步揭示AKT2在肝癌的发生、发展中的作用,观察AKT2小干扰RNA转染后的细胞体内生长情况,我们选用BALB-C裸鼠进行了体内实验观察。裸小鼠15只,随机分为3组:A.空白对照组5只:B.空载体组5只;C转染AKT2-siRNA基因组5只。于每只裸鼠腹部的前肢皮下分别接种等量的不同转染细胞（5×106/100ul/只）,接种6周后终止实验。①观察肿瘤的生长情况:实验组裸鼠的肿瘤形成与对照组相比潜伏期长,平均为22.2±1.9天,对照组及反义组肿瘤形成的潜伏期分别为13.2±1.5天、10.6±1.5天,干扰组肿瘤形成时间明显被推迟,P<0.05。同时实验组裸鼠肿瘤的生长速度慢于对照组。实验结束时实验组为421.3±30.6mm3而对照组为932.59±48.7 mm3、887.36±38.5 mm3,（P<0.05）。结果说明,AKT2小干扰RNA有效地推迟和抑制了SMMC7721细胞在裸鼠体内肿瘤的形成和生长。②透射电镜观察:干扰组细胞可见到较多的外形变圆,体积缩小,染色深,表面出芽,染色质边集,表现出明显的凋亡细胞的形态。本研究进一步揭示AKT2在肝癌的发生、发展中的作用,表明AKT2小干扰RNA基因治疗能有效地抑制肿瘤细胞在动物体内的生长速度。以此基因为靶基因进行小干扰RNA基因治疗,将有可能为人类肝癌提供有效的治疗手段。
姜波玲,肖长义,叶红[4]（2008）在《HPV L1共同保守序列多肽对多价性HPV阳性临床标本的检测》文中研究说明目的:证实HPV16 L1 C-末端448-477氨基酸序列多肽所诱导的免疫抗血清能够与多种型别HPV L1发生反应。方法:人工合成HPV L1共同保守序列短肽,用该合成短肽免疫动物获得抗短肽多克隆抗血清。用PCR方法对宫颈癌、尖锐湿疣等临床标本进行HPV型别鉴定,然后用ELISA、Western印迹、免疫组织化学3种方法检验已获得的抗HPV短肽血清抗体能否与多型别HPV阳性临床标本进行反应。结果:在ELISA实验中,HPV6,11,16,18型及其他型阳性的临床标本的抗原抗体反应均为阳性;Western印迹实验中,HPV各型别阳性的临床标本均在56×103处出现显色条带,而阴性标本没有;免疫组织化学结果发现,不同病变性质的组织反应各有特征,阳性反应仅出现于上皮之内,呈区域性,有明显界限。结论:证实了本研究寻找到的HPV L1共同保守序列确实含有HPV L1 B-细胞共同表位,其免疫形成的抗血清能与多型别HPV L1发生反应。这一发现对今后研制广谱HPV L1疫苗或广谱检测试剂盒具有重要的启示作用。
崔晓辰[5]（2008）在《A群轮状病毒单克隆抗体及免疫胶体金试纸条制备》文中提出猪轮状病毒（Porcine rotavirus,PoRV）属于呼肠孤病毒科轮状病毒属,是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原之一。被PoRV感染的仔猪主要表现为腹泻、呕吐,严重者脱水,给养猪业带来严重的危害。PoRV存在多种血清型,且各个血清型之间无交叉保护或交叉保护性很差。资料显示,我国猪群中轮状病毒的感染以A群为主,在A群PoRV中VP6蛋白是群抗原,在各毒株中高度保守。目前,我国PoRV的诊断主要还是依赖于常规实验室诊断,其操作过程复杂、耗时,并且需要昂贵的仪器。因此,针对PoRV敏感性强、特异性高并能应用于现地的快速诊断方法的建立是十分必要的。本试验以A群PoRV代表株OSU毒株（G5型）为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,制备了8株抗PoRV的单克隆抗体,分别命名为1D5、1B5、1G9、1C7、3C10、1F10、1D11、1F3。ELISA结果表明,8株单克隆抗体腹水的效价分别为:1:6400、1:12800、1:25600、1:12800、1:6400、1:6400、1:25600和1:6400。类—亚类—型鉴定结果显示,1D5、1B5和1C7属于IgM类,1G9、3C10、1F10和1F3属于IgG2b亚类,1D11属于IgG2a亚类,而其轻链均为κ链。Western-blot结果表明,1D5、1G9、1C7、1F10和1D11单克隆抗体与PoRV VP6蛋白反应,1B5、3C10和1F3单克隆抗体与PoRV VP7蛋白反应。叠加ELISA结果显示,进行抗原表位的初步分析,8株单抗识别5个不同的抗原表位,即1D5和1F10单克隆抗体针对同一表位、1G9单克隆抗体针对一个表位、1C7和1D11单克隆抗体针对同一表位、1B5和1F3单克隆抗体针对同一表位、3C10单克隆抗体针对一个表位,单克隆抗体相对亲和力大小为1B5>1D11>1D5（1C7、1F10、1F3）>1G9>3C10。胶体金免疫层析技术具有快速简便、准确直观等优点,结合单克隆抗体技术又具有良好的特异性和敏感性,是目前现地应用最广泛的一种诊断方法。本试验利用抗A群PoRV OSU毒株（G5型）VP6蛋白的1G9和1D11单克隆抗体为探针制备了检测PoRV的胶体金免疫层析试纸条。利用柠檬酸三钠还原法分别制备粒径约为20 nm和40 nm的胶体金。然后用均一性好的20 nm的胶体金标记1G9的单克隆抗体（即单克隆抗体1G9︰胶体金=8.57μg︰1 mL胶体金）,同时用纯化的1D11单克隆抗体（2.4μg/cm）和羊抗鼠IgG二抗（3.2μg/cm）包被M135硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线,与金标垫组装成试纸条。敏感性试验结果表明,本试验制备的胶体金试纸条可以检出5.4μg/mL纯化的PoRV OSU毒株抗原和1.0×103.4 TCID50/mL病毒。在特异性试验中,用制备的试纸条对PoRV OSU毒株（G5型）、PoRV JS毒株（G9型）、牛轮状病毒NCDV毒株（G6型）、羊轮状病毒LLR-85毒株（G10型）、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒进行了检测,结果显示,PoRV OSU毒株（G5型）、PoRV JS毒株（G9型）、牛轮状病毒NCDV毒株（G6型）、羊轮状病毒LLR-85毒株（G10型）为阳性,其余均为阴性。在现地试验中,对我国部分省市37份仔猪腹泻的粪便样品进行了检测,结果表明,本试验制备的胶体金试纸条与韩国的PoRV胶体金试纸条的符合率为91.7 %（11/37,12/37）。本研究结果表明,利用抗A群PoRV OSU毒株（G5型） VP6蛋白的特异性单克隆抗体建立的PoRV胶体金免疫层析试纸条具有良好的敏感性和特异性,与国外同类试剂盒有较高的符合率。该研究结果为我国PoRV的诊断及免疫预防提供技术手段。
张丽芳,周健,陈韶,蔡莲莲[6]（2007）在《人乳头瘤病毒6b L1 VLPs免疫治疗生殖道尖锐湿疣的初步研究》文中研究指明目的:研究人乳头瘤病毒（HPV）6b型L1蛋白形成的病毒样颗粒（VLPs）对女性生殖道复发性尖锐湿疣（CA）的免疫治疗作用。方法:采用HPV6bL1VLPs1μg、5μg、10μg3组剂量经0w、4w、8w免疫18例CA复发患者。分别用ELISA法和迟发性超敏反应（DTH）检测血清特异性抗体和细胞免疫效应,同时每周随访观察CA病变情况直到20w。结果:所有研究对象均能在免疫后的血清中检测到特异性抗体。各剂量组免疫前后比较,血清抗体均值间差异均有统计学意义（均P<0.05）;所有患者DTH试验均呈阳性反应。经免疫治疗后20w的观察,77.8%（14/18）的患者CA完全消退,61.1%（11/18）的患者CA于9w之内完全消退,14例CA完全消退对象随访1年未见复发。生殖道CA消退与机体DTH反应有相关性（rs=-0.746,P=0.000）。结论:HPV6bL1VLPs可用于生殖道复发性CA的免疫治疗研究。
吴芬芳[7]（2007）在《新城疫病毒样颗粒免疫效力的初步研究》文中提出本实验室采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统,已经成功获得了共表达新城疫病毒（Newcastle Disease virus, NDV）F48E9株F、HN、NP和M蛋白的重组杆状病毒rBac-F-HN-NP-M,并证明其感染Sf9细胞后,可以在细胞表面形成并释放新城疫病毒样颗粒（Newcastle disease Virus-like particles,ND-VLPs）。为了研究ND-VLPs的免疫原性和免疫效力,本研究采用蔗糖密度梯度离心法纯化释放到细胞培养上清的VLPs,并对其生物学特性进行分析。通过Western blot检测到培养上清中HN,F,NP,M蛋白的共表达,同时在负染电镜下观察到表面有纤突的类似NDV的圆形粒子,证明4种蛋白在Sf9细胞内装配成了VLPs,并以出芽的方式释放到上清。HA试验测定VLPs具有很高的凝集鸡红细胞的能力（10μg纯化的VLPs的HA效价为128）,说明HN组装入ND-VLPs以后,仍然保持血凝素的正确空间构象。试验结果表明ND-VLPs的分泌高峰是在感染后96h,单位体积（100ml感染上清）产量为1.57mg,4种蛋白的浓度范围分别为,HN:0.76-1.14μg/10μg VLPs,F:0.38-0.76μg/10μg VLPs,NP:1.14-1.52μg/10μg VLP,M:0.67-0.95μg/10μg VLPs。我们分别通过肌肉注射（辅以弗氏佐剂）和滴鼻途径（不加佐剂）,以不同剂量的ND-VLPs （10、20、25μg）免疫18日龄SPF鸡,并在首免后2周加强免疫一次,同时设PBS、NDV疫苗组及NDV疫苗+VLPs联合免疫作对照。首免后,监测血清中NDV特异性抗体滴度的动态变化。于二免后两周以3.16×103EID50的F48E9株强毒滴鼻攻毒。联合免疫组诱导产生的抗体水平显着高于其它组,提示VLPs具有良好的免疫原性,并可以提高常规疫苗的免疫效力。经肌肉注射途径免疫鸡可以诱导产生较高水平的HI、IgG及中和抗体。攻毒后,25μg VLPs实验组与NDV疫苗组、联合免疫组一样,能够100%抵抗致死剂量的NDV强毒攻击;经滴鼻途径,免疫鸡不仅可以产生较高水平的HI、中和抗体和局部粘膜抗体,还可以产生少量的循环抗体IgG。25μg ND-VLPs对致死剂量强毒的攻击也提供了90%的保护,说明ND-VLPs能够刺激机体产生粘膜免疫应答并具有一定的免疫保护力,但循环抗体IgG在抵抗强毒攻击过程中起着重要作用。ND-VLPs作为粘膜免疫抗原仍需要辅以合适的粘膜佐剂来增强其免疫效果。综上,ND-VLPs在昆虫细胞-杆状病毒表达系统上实现了高效组装,具有良好的免疫原性,并能有效的提高常规疫苗针对流行毒株的免疫效力,是一个很有前景的ND候选疫苗。
高秀春[8]（2007）在《G9型猪轮状病毒VP2/4/6/7蛋白真核表达及组装病毒样颗粒研究》文中指出猪轮状病毒（Porcine Rotavirus，PRV）属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属，是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原之一。小日龄动物最为易感，人、猪、火鸡、绵羊等多种动物都是轮状病毒的自然宿主。轮状病毒引起的腹泻是一种世界性疾病，给人类健康和畜牧业发展造成严重危害。目前，虽然有PRV疫苗可用于该病的预防，但还未有效控制该病流行，迫切需要研制新型疫苗和探索新的免疫机制来预防和控制PRV感染发病。病毒样颗粒（Virus-like particles，VLPs）在病毒形态上与真正病毒相同或相似，具有良好的免疫原性和反应原性，在疫苗研究上有广阔应用前景。国外已经有成功组装PRV VLPs的研究报道，且在疫苗研究、动物免疫试验中都取得了可喜的成果，为本实验提供了切实可行的理论依据。本研究参考GenBank已发表的PRV G5型OSU毒株VP4／6／7全长基因组序列和5株人源PRV VP2全长基因序列，分别设计合成4对引物对我国江苏分离的PRV毒株（简称JS毒株），采用RT-PCR方法扩增全基因片段，为了对VP2基因进行生物学特性分析，因此又扩增完成了OSU毒株VP2全基因片段。将扩增基因分别克隆到pMD18-T载体，筛选阳性重组质粒序列测定。测序结果显示：JS毒株与OSU毒株VP2全基因序列均为2717bp，编码890个氨基酸，同源性比较发现二者核苷酸同源性为99.9％，氨基酸同源性为99.91％，虽然二者与人wa毒株VP2基因同源性最高，但通过系统发育进化树分析，发现其与猪源HP140毒株的亲缘关系最近；VP4基因全长2342 bp，编码776个氨基酸，15株PRV A群VP4全基因序列进行同源性比较，核苷酸同源性分别在69.2～99.5％，推导氨基酸同源性在70.2～99.1％之间，氨基酸45～250位变异率较高，有突变、插入和缺失现象，其中胰酶作用位点氨基酸241、247位高度保守，系统发育进化树分析，JS毒株与OSU、JL94毒株亲缘关系最近；VP6全基因序列1320bp，编码389个氨基酸，9株PRV VP6全基因同源性比较，核苷酸同源性在77.1％～91.1％之间，氨基酸的同源性在89.7％～99.5％之间，系统发育进化树显示，10株PRV可以分为4个群，JS毒株与B131、OSU、CN86毒株亲缘关系较近，为一个群；VP7基因全长1062bp，编码326个氨基酸，与已知的15个毒株VP7全长基因的核苷酸及推导的氨基酸序列比较，同源性分别为74.5％～78.5％和75.2％～83.1％之间，核苷酸系统发育进化树结果发现，JS毒株与RV G9型参考毒株ICB2185、O-1亲缘关系较近，为一个进化群，表明JS毒株血清型为G9型。根据测序结果重新设计合成另4对引物，上游均含BamHⅠ酶切位点，下游均含SalⅠ酶切位点的，以鉴定阳性重组质粒为模板扩增目的片段后，分别克隆至真核表达载体pFastBac的BamHⅠ、SalⅠ之间的多克隆位点。经酶切、PCR和序列测定鉴定正确后，将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞，在其转座酶作用下进行转座，得到Bacmid-VP2／4／6／7重组基因组。纯化后与脂质体共转染sf9细胞，72小时后收获重组病毒，盲传3代后提取重组病毒DNA进行PCR鉴定。SDS-PAGE、Western blot分析，表明PRV JS毒株VP2、VP4蛋白获得表达并具有良好的生物学特性。为了研究PRV VLP的形态学特性，VP2重组病毒单独转染sf9细胞，培养物上清经蔗糖密度梯度离心纯化后，电镜负染观察到直径约40nm左右的核心样颗粒，在形态、直径大小上都接近真实的病毒粒子。
郑丹,张德意,石朝辉,涂权梅,欧琴,李琼英,张丽芳[9]（2007）在《人乳头瘤病毒11型E7蛋白在原核细胞的表达及其诊断尖锐湿疣的价值》文中指出目的研究人乳头瘤病毒（HPV）11型 E7蛋白在原核细胞的表达及其在尖锐湿疣（CA）血清学诊断中的应用价值。方法用 PCR 从 CA 患者组织中扩增 HPV11 E7全长基因,构建重组质粒 pET32a（+）/HPV11 E7,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导后表达,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法（WB）分析鉴定;经镍螯合亲和层析胶体（Ni-NTA Agarose）纯化 HPV11 E7融合蛋白后作抗原,用间接 ELISA 法对93例 CA 患者、43例宫颈癌患者和58名健康对照者血清标本进行 IgG 抗体检测。结果 HPV11 E7融合蛋白在原核表达系统中呈较高效表达（浓度为40μg/ml）。CA 组、宫颈癌组和健康对照组血清 IgG 抗体均值分别为1.545±0.131、0.586±0.155和0.674±0.150,阳性率分别为76.3%（71/93）、11.6%（5/43）和5.2%（3/58）;CA 组血清 IgG抗体均值及阳性率均高于宫颈癌组和对照组（均 P<0.01）。结论 HPV11 E7融合蛋白具较强的抗原性,用于 CA 血清学诊断试剂的研制具有临床应用价值。
闻晓波[10]（2006）在《新城疫病毒样颗粒的构建及其出芽机制的研究》文中进行了进一步梳理病毒样颗粒（Virus-like particles,VLP）是指含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒,不含有病毒核酸,不能自主复制,其在形态上与真正病毒粒子相同或相似,俗称为伪病毒颗粒或假病毒颗粒。近年来,VLP技术在病毒的形态学研究、病毒的组装和出芽机制的研究以及某些传染病的疫苗开发上应用广泛。例如,在人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）、人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）、丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）、戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）和轮状病毒（Rotavirus）等诸多病毒的形态发生学、病毒装配、病毒的出芽机制以及高效疫苗开发等研究上均取得了可喜的进展,VLP技术发挥了越来越重要的作用。 新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是引起禽类急性、高度接触性传染病—新城疫（Newcastle disease,ND）的病原,给养禽业造成了严重经济损失,虽然有疫苗可用于该病的预防,但由于对病原的致病机理、免疫机理了解不充分,一直没能从根本上控制该病。迄今为止,对NDV的研究局限于针对单个基因的结构与功能方面,对各基因的功能及其编码蛋白之间的相互作用还不是很清楚。本研究针对NDV出芽机制不清楚和亚单位疫苗免疫效果不理想这一重要理论和实践问题,拟以VLP技术为突破口,阐明NDV出芽的主要机制和影响因素。 由于哺乳动物细胞的转录、转译和转译后修饰的保守性,在真核细胞中表达的重组蛋白可具备功能性,可进行结构与功能的分析以及蛋白质对细胞功能生理效应的分析。杆状病毒表达系统可为高水平表达的外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物的形成提供良好的环境,能进行翻译后的加工修饰,此系统最突出的特点就是能获得重组蛋白高水平的表达。所以,本试验首次在哺乳动物细胞和昆虫细胞-杆状病毒表达系统建立NDV-LP的技术,并进一步研究VLP的形成和病毒的出芽机制,以及病毒与细胞之间相互作用的机理,并为研发新型的亚单位疫苗奠定基础。 在哺乳动物细胞表达系统中,分别构建了瞬时表达F48E9株NDV结构蛋白M、NP、F和HN的重组表达质粒pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN,采用脂质体转染HeLa细胞后。通过间接免疫荧光试验证明四个结构蛋白均能够瞬时表达成功。pCAGG-M、pCAGG-NP单独转染HeLa细胞后,进一步通过western blot试验检测到了M和NP蛋白的表达:同时pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN组合共转染HeLa细胞时,观察到明显的细胞融合现象。NDV的F蛋白为融合蛋白,具有细胞融合活性,但仅F蛋白的单独作用还不能诱导细胞融合,其功能的发挥还需要HN蛋白的协同作用。这一结果也佐证了所构建的重组表达质粒pCAGG-F和pCAGG-HN转染HeLa细胞后,F和HN蛋白得到了成功表达,并且具有功能活性。在证明重组质粒单独表达成功后,pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN共转染HeLa细胞,通过western blot在细胞培养上清中,检测到了四个结构蛋白的共表达。
二、HPV6b L1蛋白在昆虫细胞中的表达及其作为特异性诊断抗原的初步研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HPV6b L1蛋白在昆虫细胞中的表达及其作为特异性诊断抗原的初步研究（论文提纲范文）
（1）JY佐剂对人乳头瘤病毒（HPV）和乙肝病毒表面抗原（HBsAg）疫苗黏膜免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、人乳头瘤病毒及其特征概述 |
| 二、HPV疫苗研究概述 |
| 三、乙型肝炎疫苗佐剂研究概况 |
| 四、点膜疫苗研究 |
| 第一部分 JY佐剂对HPV16、18型L1 VLP黏膜免疫研究 |
| 引言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 JY佐剂对乙肝病毒表面抗原疫苗的黏膜免疫研究 |
| 引言 |
| 第一章 JY佐剂剂量对鼻腔免疫乙肝疫苗免疫效果的影响 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 第二章 乙型肝炎病毒表面抗原与JY佐剂不同配比免疫小鼠实验 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）短发卡状RNA抑制AKT2基因治疗肝癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 AKT2在肝癌组织、肝癌细胞系中的表达及意义 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 封闭人肝癌AKT2 的siRNA 片段设计、筛选、载体构建及肝癌细胞转染条件的优化 |
| 一、封闭人肝癌AKT2的siRNA片段设计及supersilencing质粒的简介 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 二、转染条件的优化 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 三、supersilencing-AKT2-siRNA载体的构建、瞬时转染的时效性及稳定株的建立 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 AKT2-siRNA对SMMC7721细胞生物学的影响 |
| 一、AKT2-siRNA对肝癌细胞增殖能力的影响及机制的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 二、AKT2-siRNA对SMMC7721迁移能力的影响及机制的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 封闭AKT2蛋白对促肝癌细胞凋亡的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第五部分 荷瘤裸鼠模型建立及AKT2-siRNA 对肝癌细胞的致瘤性影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 蛋白激酶B(PKB/AKT)与肿瘤 |
| 攻读博士学位期间公开发表的论文 |
| 中英文缩略语对照表 |
| 致谢 |
（5）A群轮状病毒单克隆抗体及免疫胶体金试纸条制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 轮状病毒概述 |
| 1.1.1 轮状病毒形态结构 |
| 1.1.2 轮状病毒分类 |
| 1.1.3 RV 的理化特性 |
| 1.1.4 RV 基因组结构特征 |
| 1.1.5 RV 蛋白及其作用 |
| 1.1.6 RV 的培养特性 |
| 1.1.7 发病机理 |
| 1.1.8 防治与疫苗 |
| 1.1.9 RV 诊断技术 |
| 1.2 胶体金技术在免疫学检测中的应用 |
| 1.2.1 胶体金技术在免疫学中的应用 |
| 1.2.2 胶体金技术的优缺点 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 1.4 主要研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒与细胞 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 阳性血清 |
| 2.1.4 免疫层析材料 |
| 2.1.5 主要试剂和溶液 |
| 2.1.6 主要仪器设备及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病毒纯化 |
| 2.2.2 病毒的鉴定 |
| 2.2.3 小鼠免疫 |
| 2.2.4 间接ELISA 检测方法反应条件的确定 |
| 2.2.5 细胞融合 |
| 2.2.6 阳性杂交瘤细胞株筛选及克隆 |
| 2.2.7 单克隆抗体细胞株的冻存、复苏及稳定性试验 |
| 2.2.8 单克隆抗体腹水的生产及预处理 |
| 2.2.9 单克隆抗体的特异性鉴定 |
| 2.2.10 单克隆抗体免疫球蛋白类—亚类—型鉴定 |
| 2.2.11 杂交瘤细胞染色体分析 |
| 2.2.12 单克隆抗体对应抗原表位分析 |
| 2.2.13 单克隆抗体的纯化与鉴定 |
| 2.2.14 胶体金颗粒的制备 |
| 2.2.15 胶体金标记抗体 |
| 2.2.16 金标垫的制备 |
| 2.2.17 印膜 |
| 2.2.18 样品垫处理液的选择 |
| 2.2.19 样品处理液的选择 |
| 2.2.20 试纸条的组装 |
| 2.2.21 试纸条的检测方法和结果判定 |
| 2.2.22 特异性试验 |
| 2.2.23 灵敏性试验 |
| 2.2.24 重复性试验 |
| 2.2.25 稳定性试验 |
| 2.2.26 现地试验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 病毒纯化后的鉴定 |
| 3.2 间接ELISA 反应条件的确定 |
| 3.3 饲养细胞的制备结果 |
| 3.4 骨髓瘤细胞的制备结果 |
| 3.5 细胞融合与筛选 |
| 3.6 杂交瘤细胞培养上清及腹水单抗效价的测定 |
| 3.7 杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性试验 |
| 3.8 单克隆抗体的特异性分析 |
| 3.8.1 PoRV 抗原捕获ELISA 试验分析 |
| 3.8.2 IFA 检测8 株单抗与PoRV 的反应性 |
| 3.8.3 Western-blot 分析 |
| 3.9 单克隆抗体免疫球蛋白类—亚类—型鉴定 |
| 3.10 杂交瘤细胞染色体分析 |
| 3.11 腹水单抗饱和值测定 |
| 3.12 单克隆抗体对应的抗原表位分析 |
| 3.13 单克隆抗体的纯化 |
| 3.14 胶体金的制备及粒径选择 |
| 3.15 胶体金标记抗体 |
| 3.15.1 胶体金标记抗体最适稳定量的测定结果 |
| 3.15.2 胶体金标记抗体最适pH 的测定 |
| 3.16 金标垫的制备 |
| 3.16.1 金标单抗浓度的确定 |
| 3.16.2 金标垫处理液的选择 |
| 3.17 印膜 |
| 3.17.1 硝酸纤维素膜的选择 |
| 3.17.2 单克隆抗体1D11 及羊抗鼠IgG 二抗包被浓度确定 |
| 3.17.3 包被液的选择 |
| 3.17.4 封闭液的选择 |
| 3.18 样品垫处理液的选择 |
| 3.19 样品处理液的选择 |
| 3.20 试纸条的组装及结果判定 |
| 3.21 试纸条的敏感性及特异性试验 |
| 3.22 试纸条重复性试验 |
| 3.23 试纸条稳定性试验 |
| 3.24 现地试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 轮状病毒感染流行特点及实验动物标准化 |
| 4.2 单克隆抗体的制备 |
| 4.2.1 病毒纯化 |
| 4.2.2 免疫方法的选择 |
| 4.2.3 细胞融合 |
| 4.2.4 间接ELISA 方法的建立 |
| 4.2.5 单克隆抗体的特性鉴定及初步应用 |
| 4.3 胶体金免疫层析诊断方法的建立 |
| 4.4 胶体金性质 |
| 4.5 抗体的纯化 |
| 4.6 蛋白质与胶体金的吸附 |
| 4.7 胶体金免疫层析试纸条的敏感性 |
| 4.7.1 胶体金标记抗体的浓度 |
| 4.7.2 膜对蛋白的吸附量 |
| 4.7.3 免疫层析材料的选择 |
| 4.8 胶体金免疫层析试纸条的特异性 |
| 4.9 胶体金粒径的选择 |
| 4.10 点样环境 |
| 4.11 试纸条的组装及保存 |
| 4.12 试纸条的检测效果及存在问题 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
（6）人乳头瘤病毒6b L1 VLPs免疫治疗生殖道尖锐湿疣的初步研究（论文提纲范文）
| 1 对象和方法 |
| 1.1 对象 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 HPV6b L1 VLPs: |
| 1.2.2 免疫: |
| 1.2.3 抗体检测: |
| 1.2.4 DTH试验: |
| 1.3 统计学处理方法所有数据采用SPSS11. |
| 2 结果 |
| 2.1 HPV6b L1 VLPs的鉴定 |
| 2.2血清特异性抗体反应 |
| 2.3 DTH检测结果 |
| 2.4 临床观察结果 |
| 3 讨论 |
（7）新城疫病毒样颗粒免疫效力的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究目的和意义 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.3 拟解决的问题 |
| 第二章 试验研究 |
| 2.1 材料、试剂和仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 第三章 试验结果 |
| 3.1 重组杆状病毒的PCR 鉴定 |
| 3.2 重组杆状病毒滴度(pfu/ml)的测定 |
| 3.3 VLPs的纯化和鉴定 |
| 3.4 动物试验结果 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 构建VLPs所需表达系统的选择 |
| 4.2 ND-VLPs的纯化和鉴定 |
| 4.3 ND-VLPs的免疫原性及免疫效力研究 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）G9型猪轮状病毒VP2/4/6/7蛋白真核表达及组装病毒样颗粒研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 轮状病毒概述 |
| 1.1.1 轮状病毒生物学特性 |
| 1.1.2 RV的理化特性 |
| 1.1.3 RV的培养特性 |
| 1.1.4 RV血清群和血清型 |
| 1.1.5 RV的分子生物学特性 |
| 1.1.6 RV蛋白及其作用 |
| 1.1.7 RV疫苗的研究进展及存在问题 |
| 1.2 病毒样颗粒概述 |
| 1.2.1 VLPs在基础研究中的应用 |
| 1.2.2 VLPs在囊膜病毒出芽过程中的研究 |
| 1.2.3 VLPs在免疫预防和疫苗开发中的应用 |
| 1.2.4 作为免疫原 |
| 1.2.5 作为治疗性疫苗 |
| 1.2.6 VLPs疫苗 |
| 1.2.7 血清学诊断 |
| 1.2.8 存在的问题与展望 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 1.4 主要研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒与细胞 |
| 2.1.2 质粒与菌种 |
| 2.1.3 阳性血清、阴性血清 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 主要仪器设备及耗材 |
| 2.1.6 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物 |
| 2.2.2 RT-PCR |
| 2.2.3 PCR扩增产物电泳 |
| 2.2.4 目的片段回收纯化 |
| 2.2.5 目的片段克隆 |
| 2.2.6 序列测定与同源性比较 |
| 2.2.7 重细表达载体的构建 |
| 2.2.8 重组质粒Pb-VP2/4/6/7、重组Bacmid-VP2/4/6/7鉴定 |
| 2.2.9 重组基因组序列测定 |
| 2.2.10 纯化质粒与杆状病毒共转染 |
| 2.2.11 重组杆状病毒的噬斑纯化、鉴定与增殖 |
| 2.2.12 VP2/4/6/7在杆状病毒中表达产物的检测 |
| 2.2.13 透射电镜观察VLP结构 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 PRVVP2/4/6/7基因的PCR扩增与克隆 |
| 3.1.1 RT-PCR结果 |
| 3.1.2 重组克隆载体PCR鉴定 |
| 3.1.3 阳性重组子序列测定及同源性比较 |
| 3.2 重组质粒Pb-VP2/4/6/7酶切及pF-VP2/4/6/7PCR鉴定 |
| 3.2.1 重组质粒Pb-VP2/4/6/7酶切鉴定 |
| 3.2.2 重组Bacmid-VP2/4/6/7PCR鉴定 |
| 3.2.3 重组质粒Pb-VP2/4/6/7、Bacmid-VP2/4/6/7纯化后浓度和纯度测定 |
| 3.3 重组质粒转染sf9细胞 |
| 3.3.1 重组质粒Pb-VP2/4/6/7转染sf9细胞 |
| 3.3.2 重组Bacmid-VP2/4/6/7转染sf9细胞 |
| 3.3.3 重组杆状病毒鉴定 |
| 3.4 真核表达及表达产物的检测 |
| 3.4.1 SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)检测表达产物 |
| 3.4.2 Westrenblot检测表达蛋白 |
| 3.5 透射电镜观察VLP结构 |
| 4讨论 |
| 4.1 PRV血清型及进化 |
| 4.2 PRV JS毒株结构蛋白分子特性分析 |
| 4.2.1 核衣壳蛋白VP2 |
| 4.2.2 血凝素抗原VP4 |
| 4.2.3 群抗原VP6 |
| 4.2.4 中和抗原VP7 |
| 4.3 目的蛋白杆状病毒/昆虫细胞的真核表达 |
| 4.4 VLP形成及其免疫 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
（9）人乳头瘤病毒11型E7蛋白在原核细胞的表达及其诊断尖锐湿疣的价值（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
（10）新城疫病毒样颗粒的构建及其出芽机制的研究（论文提纲范文）
| 第一章 绪论 |
| 1 VLP在基础研究中的应用 |
| 1.1 VLP在病毒形态发生学方面的研究 |
| 1.2 VLP在病毒组装和复制过程中的研究 |
| 1.3 VLP在囊膜病毒出芽过程中的研究 |
| 2 病毒样颗粒在预防医学和疫苗开发中的应用 |
| 2.1 VLP在HIV的研究与应用 |
| 2.2 VLP在HPV的研究与应用 |
| 2.3 VLP在HCV的研究与应用 |
| 2.4 VLP在HEV的研究与应用 |
| 2.5 在其他病毒性疫苗研制中的作用 |
| 3 耦联VLP疫苗 |
| 4 VLP在分子载体中的研究应用 |
| 5 VLP在免疫测定中的应用 |
| 5.1 在抗原检测中的应用 |
| 5.2 在抗体检测中的应用 |
| 6 存在的问题与展望 |
| 7 本研究的目的与意义 |
| 第二章 新城疫病毒样颗粒在哺乳动物细胞内的出芽 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2.1 质粒与菌株 |
| 2.2.2 酶与标记物 |
| 2.2.3 细胞培养用试剂 |
| 2.2.4 仪器设备 |
| 2.2.5 引物 |
| 2.2.6 DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.2.7 M、NP、F和HN基因的克隆 |
| 2.2.8 重组表达载体的构建 |
| 2.2.9 重组质粒的纯化 |
| 2.2.10 间接免疫荧光试验 |
| 2.2.11 重组质粒共转染HeLa细胞 |
| 2.2.12 重组质粒共转染Vero细胞 |
| 2.2.13 抗NDV M和NP蛋白阳性血清的制备 |
| 2.2.14 Western blot检测M、NP蛋白的表达 |
| 2.2.15 Western blot检测M、NP、F和HN蛋白的共表达 |
| 2.2.16 透射电镜样品的制备 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 重组质粒的构建 |
| 2.2.2 间接免疫荧光试验 |
| 2.2.3 pCAGG-M与pCAGG-NP、pCAGG-F、pCAGG-HN组合共转染HeLa细胞 |
| 2.2.4 pCAGG-M与pCAGG-NP、pCAGG-F、pCAGG-HN组合共转染Vero细胞 |
| 2.2.5 原核表达NDV的M蛋白和NP蛋白 |
| 2.2.6 western blot检测M和NP蛋白在HeLa细胞上的表达 |
| 2.2.7 western blot检测M、NP、F和HN蛋白在HeLa细胞上的共表达 |
| 2.2.8 透射电镜结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 新城疫病毒样颗粒在昆虫细胞内的出芽 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 质粒与菌株 |
| 3.1.2 酶与标记物 |
| 3.1.3 扩增引物 |
| 3.1.4 突变引物 |
| 3.1.5 F和NP基因的点突变过程 |
| 3.1.6 M和HN基因的扩增 |
| 3.1.7 M、NP、F和HN全长基因的亚克隆 |
| 3.1.8 pAcAB4-F、pAcAB4-F-NP-M和pAcAB4-F-NP-M-HN杆状病毒转移载体的构建 |
| 3.1.9 pAcAB4-NP、pAcAB4-NP-M和pAcAB4-NP-M-HN杆状病毒转移载体的构建 |
| 3.1.10 pAcAB4-M和pAcAB4-HN杆状病毒转移载体的构建 |
| 3.1.11 转染用质粒的纯化 |
| 3.1.12 Sf9昆虫细胞的复苏 |
| 3.1.13 转染昆虫细胞 |
| 3.1.14 重组杆状病毒的PCR鉴定 |
| 3.1.15 蚀斑纯化重组杆状病毒 |
| 3.1.16 间接免疫荧光试验 |
| 3.1.17 M，NP，F和HN蛋白的共表达 |
| 3.1.18 M，NP，F和HN蛋白的单独表达 |
| 3.1.19 细胞超薄切片样品制作和观察 |
| 3.1.20 透射电镜观察VLP结构 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 F和NP基因的点突变 |
| 3.2.2 M和HN基因的克隆 |
| 3.2.3 杆状病毒转移载体的构建过程 |
| 3.2.4 蚀斑纯化重组杆状病毒的PCR鉴定 |
| 3.2.5 间接免疫荧光试验结果 |
| 3.2.6 M，NP，F和HN蛋白在昆虫细胞内的共表达 |
| 3.2.7 M，NP，F和HN蛋白在昆虫细胞内的单独表达 |
| 3.2.8 细胞超薄切片 |
| 3.2.9 负染电镜结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 简历 |
四、HPV6b L1蛋白在昆虫细胞中的表达及其作为特异性诊断抗原的初步研究（论文参考文献）
- [1]JY佐剂对人乳头瘤病毒（HPV）和乙肝病毒表面抗原（HBsAg）疫苗黏膜免疫研究[D]. 麻粉莲. 中国疾病预防控制中心, 2013(03)
- [2]HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合DNA诱导BALB/c小鼠产生特异性细胞免疫的研究[J]. 石朝辉,朱珊丽,许文,陆丽君,李玲玲,张丽芳. 中华微生物学和免疫学杂志, 2010(10)
- [3]短发卡状RNA抑制AKT2基因治疗肝癌的实验研究[D]. 谢毅. 苏州大学, 2010(10)
- [4]HPV L1共同保守序列多肽对多价性HPV阳性临床标本的检测[J]. 姜波玲,肖长义,叶红. 肿瘤, 2008(10)
- [5]A群轮状病毒单克隆抗体及免疫胶体金试纸条制备[D]. 崔晓辰. 东北农业大学, 2008(03)
- [6]人乳头瘤病毒6b L1 VLPs免疫治疗生殖道尖锐湿疣的初步研究[J]. 张丽芳,周健,陈韶,蔡莲莲. 温州医学院学报, 2007(05)
- [7]新城疫病毒样颗粒免疫效力的初步研究[D]. 吴芬芳. 新疆农业大学, 2007(02)
- [8]G9型猪轮状病毒VP2/4/6/7蛋白真核表达及组装病毒样颗粒研究[D]. 高秀春. 东北农业大学, 2007(02)
- [9]人乳头瘤病毒11型E7蛋白在原核细胞的表达及其诊断尖锐湿疣的价值[J]. 郑丹,张德意,石朝辉,涂权梅,欧琴,李琼英,张丽芳. 中华检验医学杂志, 2007(03)
- [10]新城疫病毒样颗粒的构建及其出芽机制的研究[D]. 闻晓波. 中国农业科学院, 2006(10)