一、重组人血清白蛋白在Pichia pastoris中的表达与纯化（论文文献综述）
王明宇[1]（2021）在《基于蛋白质的智能型抗肿瘤药物纳米递送系统的设计及性能研究》文中指出癌症的药物开发与治疗一直是生物医药领域的研究热点。尽管近年来免疫检查点抑制剂药物已有明确的突破,但治疗效果客观上还是严重依赖提高给药剂量。临床广泛应用的化疗药物多数水溶性较差、生物利用度低、毒副作用大,致使难以达成理想的有效治疗给药剂量。即使是治疗效果明确的靶向药物,其在体内的动力学过程也只是具有药物分布的广泛性和作用发生的靶向性特征,治疗效果也受制于给药剂量。在目前新药化合物发现和改造还难以显着突破大剂量给药的情况下,从制剂材料学角度改善这个难题已受到行业的广泛关注。采用纳米粒包载难溶性化疗药物,改善药物的溶解度,提高对肿瘤组织的靶向性,达到“减毒增效”的案例已有报道。但这些纳米药物递送系统仍然存在化学治疗药在靶组织中蓄积量少、药物在靶组织部位释放的影响因素多,以及单纯化学药治疗具有局限性等共性问题。本论文以机体自身固有的蛋白质为材料,设计和制备了生物相容性好、靶向性强、对肿瘤微环境有多重响应性释放药物的纳米药物载体,并对其作为新制剂开发的辅料性能进行评价。主要研究结果如下:（1）基于肿瘤微环境细胞外基质中普遍存在较高浓度的基质金属蛋白酶2（MMP-2）和透明质酸酶（HAase）的研究报道,设计和制备了以两种酶的底物I型胶原蛋白和透明质酸为门控和靶向分子的介孔二氧化硅纳米粒。以临床已明确有治疗作用的盐酸阿霉素（Dox）为实验例,制备得到包载Dox的双酶响应型纳米递药系统（FMSN-Dox-C2H）。设计的介孔二氧化硅纳米粒自带绿色荧光,而Dox带有红色荧光,能够可视化评价FMSN-Dox-C2H纳米粒的功能响应。FMSN-Dox-C2H纳米粒是160×80 nm的圆柱体,具有低吸附白蛋白的性状,胶原蛋白和透明质酸的接枝率分别为8%和6%,载药量为9.9±0.3%。体外药物释放实验发现,对FMSN-Dox-C2H组添加MMP-2和HAase,其72 h后的Dox释放率可达70.3±7.5%,而不加酶的对照组释放率仅为7.06±2.8%,达到了采用胶原蛋白和透明质酸封堵粒子孔道,提高纳米粒在体液中的稳定性,以及双酶门控释放药物的设计目的。以不表达MMP-2和HAase的正常细胞株Cos-7和低表达两种酶的肝癌细胞Hep G2为参照,发现FMSN-Dox-C2H纳米粒对高表达两种酶的宫颈癌细胞He La具有剂量依赖关系的杀伤作用。激光共聚焦显微镜观察到Dox扩散进入He La细胞的量明显高于Hep G2细胞的量,提示纳米粒对双酶的响应性符合有效释放阿霉素的设计预期,透明质酸对He La细胞表面存在的相应受体CD44的靶向作用也是这种胞内浓度差异的可能解释。FMSN-Dox-C2H纳米粒的荷He La细胞瘤小鼠CDX模型的体内实验结果也验证了这种解释的可能性。（2）鉴于体内无法降解介孔二氧化硅纳米粒和已上市的注射用白蛋白结合型紫杉醇制剂生产质量控制的技术难点,论文采用基因重组技术设计了两端分别插入不同重复度的多聚组氨酸（His）、MMP-2酶切位点和RGD肽的人血清白蛋白（HSA）融合基因序列,实现了系列融合蛋白在毕赤酵母系统中的表达。筛选获得分子质量为71796 Da的含18个His的融合白蛋白（3RGD-HSA-MMP-18His,RHMH18）可以简单和可控的实现自组装,形成的纳米颗粒呈规则的球形,直径约为100 nm。包载紫杉醇（PTX）后制备的RHMH18纳米粒,载药量为6.6±0.3%。添加MMP-2和改变p H的72 h药物释放率可达到68.7±4.2%,显着高于对照组的释放量（6.2±0.9%）,且实验发现RHMH18纳米粒的药物释放率与其组氨酸的数量呈正相关。以RGD受体ανβ3-整联蛋白表达量为依据,选择低表达的乳腺癌MCF-7细胞和高表达的肺腺癌A549细胞、MGC-803细胞为测试细胞,发现RHMH18纳米粒具有明显的ανβ3靶向性和对MMP-2的敏感性。RHMH18纳米粒在荷MGC-803细胞瘤和A549细胞瘤小鼠CDX模型的体内实验结果也验证了体外实验结果的可靠性,并观察到纳米粒组PTX的体内半衰期可达到63.36 h,LD50为58.5mg/kg/day。上述结果提示,RHMH18纳米粒的设计可达到I型胶原蛋白和透明质酸为门控和靶向分子的介孔二氧化硅纳米粒的药用效果,且这种RHMH18来源明确,功能多样,质量单一可控,自组装的纳米粒大小均一,包载药物均衡,显着优于分子质量范围较大的I型胶原蛋白和透明质酸,利于作为制备相应药物制剂的辅料;体内实验结果显着提升了PTX给药剂量的安全性和在肿瘤部位的药物浓度,具有明显的治疗效果。RHMH18纳米粒与已上市的注射用白蛋白结合型紫杉醇制剂在技术上都是利用白蛋白表面的疏水区域自组装来解决难溶药物的制剂制备难题,但作用原理不同。前者是通过白蛋白上融合的多聚His在不同p H条件下亲疏水的变换包载/释放药物,并通过RGD肽靶向ανβ3-整联蛋白,以达成在肿瘤组织中的药物高聚集度,理论上优于后者的胞内释放药物的作用机制。加上设计的带多聚His的RHMH18自组装能力强,明确改善了后者在生产中质量控制难度大的缺点。（3）为了提升RHMH18纳米粒的载药能力,多功能协同治疗肿瘤的需求,设计和制备了共包载金纳米粒和相对极性的多西他赛药物的RHMH18@Au D,其载药率为18.5±0.9%,粒径80 nm。以多西他赛的肿瘤治疗适应症为依据,选择高表达RGD受体ανβ3-整联蛋白的卵巢癌A2780细胞为测试细胞,发现包载多西他赛的RHMH18@Au D纳米粒兼具有明确的肿瘤细胞靶向性、肿瘤微环境酶响应性和p H响应性,以及产生光热效应的特点。系统考察了光照强度、时间、溶液p H对RHMH18@Au D纳米粒光热效率产生的影响,发现其热效应最高可达56.8°C。包载多西他赛的RHMH18@Au D纳米粒在荷A2780细胞瘤小鼠CDX模型的体内实验结果验证了纳米粒具有化药-光热协同治疗的效果,模型动物的生存期评估显示,经协同作用治疗的动物生存期长于单纯化学药治疗的对照组,并且可以减半给药剂量达到单纯化学药治疗的抑瘤生长率。提示设计的RHMH18@Au具有多重功能性,既可提高纳米粒的载药水平,改善制剂包载极性药物的能力,也为肿瘤联合治疗方法提供了手段。
苏悦[2]（2020）在《微生物高效表达异源豆血红蛋白的研究》文中提出豆血红蛋白是一种植物来源血红蛋白,可大幅提高植物性肉制品口感和风味的拟真性,但从大豆根瘤中提取豆血红蛋白不具有经济性。本课题开展微生物高效表达豆血红蛋白的探索研究,具有重要的应用前景。首先以大肠杆菌为宿主,将来源于大豆的豆血红蛋白基因进行密码子优化后,构建了能表达重组豆血红蛋白的大肠杆菌菌株,初步优化了摇瓶发酵条件后豆血红蛋白产量达到0.17 g/L,说明重组蛋白微生物生产的可行性。其次,以毕赤酵母为宿主,通过选择合适的启动子,分别构建了含有AOX1启动子、GAP启动子和缺失d1区域AOX1启动子的豆血红蛋白表达重组菌,通过提高抗生素浓度,筛选得到高效表达重组菌dd1A-1,经甲醇诱导后豆血红蛋白分泌表达量达到了 0.12 g/L。最后,在摇瓶水平上对毕赤酵母发酵条件进行了初步优化后,将重组菌豆血红蛋白分泌表达量提高了 66.7%,达到了 0.2g/L。总之,本研究在大肠杆菌和毕赤酵母中有效地实现了豆血红蛋白的异源表达,并通过优化摇瓶发酵条件明显提高了表达水平。最后在摇瓶条件下,毕赤酵母重组菌的豆血红蛋白分泌表达量达到了 0.2 g/L。本文这一初步工作对于豆血红蛋白的工业化生产具有重要的参考价值。
高晓娟[3]（2020）在《采用融合白蛋白结合域和FcRn结合域改善CD47纳米抗体体内代谢动力学》文中研究指明单克隆抗体因其对靶点的高度选择性正在成为治疗癌症和自身免疫等疾病的首选药物。但是,由于单抗复杂的多结构域特点和大分子属性,使得其在应用上受到了一定的限制。纳米抗体是源自骆驼重链可变区的单域抗体,也是目前已知分子量最小且具有完全抗原结合能力的抗体片段,可作为单抗的理想替代。然而,由于纳米抗体分子小和缺乏Fc结构,体内半衰期过短,不能获得有效的体内治疗效果。因此,需要发展延长纳米抗体半衰期的策略,以改善其体内代谢特性。当前主要采用聚乙二醇化、融合Fc片段、与白蛋白结合以及靶向FcRn等策略延长小分子药物的血浆半衰期。但哪种方法对于延长纳米抗体的半衰期更有效,目前未见相关报道。因此,在本研究中,我们选择白蛋白结合域（ABD）和新生Fc受体结合域(ZFcRn),将其与我们前期获得的一株CD47特异的纳米抗体3D3-2进行融合,并在小鼠体内评价和比较了两种融合策略对改善纳米抗体半衰期的效果。本研究主要包括以下两部分:1.融合ABD和ZFcRn的重组CD47纳米抗体的制备和鉴定采用DNA重组技术,将合成的ABD和ZFcRn的DNA序列与纳米抗体3D3-2在羧基端通过一段连接子（G4S）3进行融合,并连接到表达载体上,构建重组质粒p ET22b-3D3-2-ABD和p ET22b-3D3-2-ZFcRn,转化大肠杆菌BL21（DE3）并进行IPTG诱导表达。表达的融合蛋白采用Ni离子亲和色谱柱纯化。结果显示,转化重组质粒的表达菌经过IPTG诱导后,在SDS-PAGE胶上显示明显的重组ABD和ZFcRn融合蛋白的表达,分子量大小分别为27 k Da和28 k Da,与预期相符。表达的纳米抗体经过亲和纯化后获得了纯度90%以上的纯化抗体,得率分别为5.5 mg/L和6.5 mg/L。Western blot显示其能与特异抗体结合。2.重组纳米抗体3D3-2-ABD和3D3-2-ZFcRn的抗原结合及体内半衰期分析为了解融合ABD和ZFcRn对纳米抗体3D3-2与CD47抗原和血清白蛋白（SA）结合的影响,采用间接ELISA检测了3D3-2、3D3-2-ABD和3D3-2-ZFcRn重组纳米抗体与人CD47、人血清白蛋白（HSA）以及鼠血清白蛋白（MSA）的结合,结果显示,三种纳米抗体与CD47之间均具有较高的特异结合活性,并具有明显的浓度依赖性。与3D3-2相比,融合后的3D3-2-ABD与3D3-2-ZFcRn与CD47的结合能力有一定降低,但不显着（p>0.05）。融合ABD结构域的纳米抗体获得了较强的与HSA和MSA特异结合能力,并具有明显的浓度依赖性。而融合了ZFcRn结构域的纳米抗体没有显示出与重组蛋白FcRn的结合活性。为了解融合ABD和ZFcRn对纳米抗体3D3-2延长血浆半衰期的作用效果,我们将三种重组纳米抗体对ICR小鼠进行单次尾静脉注射,在注射后的不同时间点采集血清样本,采用双抗体夹心ELISA法测定各个时间点血清中纳米抗体的浓度,并使用数据处理软件Graphpad prism 5绘制药时曲线并计算终末半衰期。结果显示,融合了ABD结构域的纳米抗体3D3-2-ABD比未融合的纳米抗体3D3-2血浆半衰期延长了约14倍,融合前后血浆半衰期分别为35.82 min和501.52min。而融合了ZFcRn结构域的纳米抗体3D3-2-ZFcRn血浆半衰期为71.65 min,与未融合抗体相比,效果不明显。另外值得注意的是,三种纳米抗体在对小鼠注射后7天都检测到了鼠抗纳米抗体的抗体反应,表明都具有免疫原性。总结以上结果,本研究通过融合ABD和ZFcRn结构域获得了两种新的重组CD47纳米抗体,融合ABD和ZFcRn不影响纳米抗体与CD47抗原的结合,而融合ABD后CD47纳米抗体可以与HSA和MSA特异结合。小鼠体内代谢实验表明,纳米抗体与ABD融合后可以显着提高其血浆半衰期。本研究结果为延长纳米抗体体内代谢提供了一种可行的策略,对改善纳米抗体药物的体内药效具有一定参考价值。
许人仁[4]（2020）在《重组人血清白蛋白的发酵及纯化工艺研究》文中提出人血清白蛋白（Human Serum Albumin,HSA）源自人体最大的脏器-肝脏,在血液中占比最高,主要运输脂肪酸、氨基酸等营养物质,同时能够维持血液渗透压的平衡,稳定血浆内环境。临床上用于医治休克、大面积烧伤,以及大出血导致的血含量降低,同时也是国家的储备药物之一。白蛋白主要通过低温乙醇法和柱层析法从人血浆中获得,原料来源不稳定且易携带各类血液病毒。目前已有多种表达体系生产重组人血清白蛋白（Recombinant Human Serum Albumin,r HSA）,其中毕赤酵母使用较为广泛。本课题以实验室构建的GS115-p PIC9K-hsa-5-4为表达菌株,鉴于有机培养基BMGY罐上发酵时间短,发酵培养基色素多,尝试用无机培养基BSM取代BMGY菌体湿重为500 g/L,诱导192 h目的蛋白的表达量为11.46 g/L,均高于BMGY培养基。选择不同盐浓度的BSM进一步优化培养基,发现1/4 BSM不能满足长时间发酵的营养需求,采用1/2BSM培养基能满足长时间高密度发酵,在诱导192 h后获得17.47 g/L的产量。对发酵获得的重组人血清白蛋白进行纯化,为保证储存中目的蛋白不被降解,首先采用热处理方式将发酵液中蛋白酶灭活,便于后续纯化;随后优化Blue Sepharose亲和层析中上样和洗脱p H,确定最终上样和洗脱p H分别为5和7,目的蛋白纯度达到94.67%;接着Phenyl Sepharose疏水层析能够进一步去除产物中色素和其他杂质,将纯度提高至97.348%,两步纯化的总回收率超过61%。利用Con A亲和填料与多糖的特异性亲和力将目的蛋白与多糖杂质分离,获得产物的回收率是68.91%。借助蒽酮-硫酸检测Con A亲和层析检测前后溶液中多糖（甘露聚糖等）含量的变化,最终溶液中多糖（甘露聚糖等）含量为2.41mg/L,低于同等条件下血浆来源人血清白蛋白（Plasma Human Serum Albumin,p HSA）中多糖的含量（6.59mg/L）。为进一步提高目的蛋白纯度,除去构象不正确的白蛋白,以p HSA为抗原免疫小鼠,通过杂交瘤技术筛选获得一株杂交瘤细胞株7H5,产生的单克隆抗体与p HSA有较强的亲和力,经ELISA检测抗体效价大于10-5,Western blot验证了纯化的单抗与重组人血清白蛋白具有特异性结合。将该抗体与溴化氢活化的琼脂糖偶联制备针对HSA的免疫亲和层析（Immunoaffinity Chromatography,IAC）柱,回收率为95.95%。r HSA经该亲和柱纯化后使用灵敏度极高的Pichia pastoris Host Cell Proteins Kit检测宿主细胞蛋白含量,计算目的蛋白纯度为99.9666%,总回收率为40.998%。
葛程童[5]（2020）在《人血白蛋白的分离配基设计和重组人血白蛋白分离研究》文中提出人血白蛋白（human serum albumin,HSA）在临床治疗中具有广泛用途,利用基因工程技术生产重组人血白蛋白（recombinant human serum albumin,rHS A）有利于缓解HSA供给紧张的问题,且可避免血源性病原体风险。分离纯化是rHSA制备的难点,研发高性能的新型分离配基具有重要意义。本论文选取HSA位点Ⅱ为靶点,基于天然配基L-色氨酸,借助分子模拟设计新型分离配基,并制备新型介质,用于从毕赤酵母发酵液中分离rHSA。首先通过分子模拟研究了 HSA位点Ⅱ与L-色氨酸的结合机理,发现L-色氨酸的羧基和吲哚基对结合起关键作用。设计了 7个含有羧基和吲哚基的配基,分子模拟结果表明吲哚-3-戊酸（DL-5）配基与HSA结合的能力最强。为了便于介质制备,进一步设计了与DL-5结构相似的吲哚-3-乙酸-半胱氨酸（IAA-CYS）配基,分子模拟发现IAA-CYS配基与HSA结合的能力与DL-5接近。采用IAA-CYS配基制备了 IAA-CYS介质,与布洛芬进行了 HSA竞争性结合实验,结果表明HSA位点Ⅱ是潜在的IAA-CYS配基结合位点。构建了IAA-CYS-空间臂分子模型,通过分子模拟探讨了配基与HSA的结合机理。发现结合以静电相互作用为主,疏水相互作用为辅,其中羧基作用较大。考察了 IAA-CYS介质的HSA吸附性能,发现pH 4.0-5.0、NaCl浓度0-1.0 M范围内,HSA吸附量均高于100 mg/mL。pH 4.5是合适的HSA吸附条件,饱和吸附容量达到157.6mg/mL,且盐浓度影响较小。当线性流速100cm/h时,HSA动态载量达到59.1 mg/mL;添加200 mMNaCl,HSA动态载量仍有55.2 mg/mL。优化了分离条件,从毕赤酵母发酵液中分离rHSA,pH 4.5上样,pH 5.0和400 mM NaCl 冲洗,pH 8.0 和 200 mM NaCl 洗脱,rHSA 纯度为 90.1%,收率 88.6%。本论文针对HSA分离,设计了 IAA-CYS新配基,制备了 IAA-CYS新介质,实现了从毕赤酵母发酵液中分离rHSA,上样和洗脱条件温和,上样量较大,耐盐性好,料液不用稀释处理,且分离得到的rHSA纯度和收率均较高,显示了良好的应用前景。
焦梁成[6]（2019）在《毕赤酵母分子操作方法改进及其在米根霉脂肪酶高效表达中的应用》文中进行了进一步梳理米根霉脂肪酶（Rhizopus oryzae lipase,ROL）为1,3位置专一性脂肪酶,具有良好的水解和酯化活性,广泛应用于食品加工、生物柴油制备及手性化合物拆分等工业领域,但其天然产量极低,难以满足工业需求。利用基因工程技术提高ROL的表达量,对促进其工业化应用有着重要意义。毕赤酵母具有遗传操作方便、能执行蛋白翻译后修饰和易于高密度发酵等优点,已被成功用于多种蛋白的高效异源表达。通常采取增加基因拷贝数和共表达分子伴侣的策略来提高毕赤酵母中重组蛋白的表达水平,但由于毕赤酵母可用筛选标记有限,使用现有的分子生物学方法进行多次基因操作相对困难,在一定程度上限制了多种基因工程策略的协同应用。为此,本文一方面探究并改进了多种毕赤酵母基因操作方法,另一方面采用合适的改进方法,结合选择强启动子、筛选最佳基因剂量以及联合共表达多途径辅助因子等策略,最终获得了多株ROL高产重组菌,并通过3-L高密度发酵实现了ROL的高水平表达,为重组ROL的规模化生产及工业化应用奠定了理论及方法学基础。主要研究内容和结果摘要如下:1.探究影响ROL在毕赤酵母中高效表达的关键因子,表明基因剂量的影响最大。初步考察了米根霉脂肪酶前序列、载体整合位点、启动子和基因剂量对重组ROL在毕赤酵母中表达的影响,结果发现前序列和基因剂量对ROL表达的影响较大。为此,以含前序列的ROL（proROL）为出发基因,通过增加基因剂量,筛选到一株酶活力高达1200 U/mL的重组菌株GS115/9K-Zα-Hα-proROL 3#。对该菌株在摇瓶和3-L高密度发酵的条件进行了优化,最终获得的最高脂肪酶活力达11,500 U/mL。2.探索了转化后介导载体扩增法（posttransformational vector amplification,PTVA）实现毕赤酵母基因拷贝数增加的机制,发现PTVA并不总是导致整个外源载体的拷贝数增加。成功构建了抗生素基因两端不含任何相同DNA片段的重组菌GS115/Zeocin和抗生素基因两端含pAOX1、AOX1-TT和5’AOX等多对重复DNA片段的重组菌GS115/Zα-ROL-5’AOX。研究发现重组菌GS115/Zeocin不适宜进行PTVA筛选,而重组菌GS115/Zα-ROL-5’AOX抗生素基因两端重复的pAOX1、AOX1-TT和5’AOX片段均能介导PTVA中抗生素基因的复制扩增。3.通过多拷贝载体优化基因拷贝数,提高ROL在毕赤酵母中的表达水平。首先构建了ROL基因单拷贝表达载体pAOα-ROL,并通过优化的“生物砖”法构建了含2至8拷贝ROL基因重组载体,以此构建了含1至8拷贝ROL基因的重组菌株GS115/pAOα-nROL（n=1,2,3…8）。摇瓶发酵结果表明,含5拷贝ROL基因的重组菌GS115/pAOα-5ROL 11#产酶活力最高,达2700 U/mL,较单拷贝重组菌提高了近8倍;以山梨醇/甲醇混合补料,该重组菌3-L高密度发酵115 h后最高酶活力达20,500U/mL。4.共表达辅助蛋白,进一步增强ROL在重组菌中的表达。在GS115/pAOα-5ROL11#重组菌中分别共表达了12种不同的辅助蛋白,发现Ssa4、Bmh2、Sso2、Ubc1、Hrd1、Pdi、Bip、Hac1和VHb等9种辅助蛋白均能促进ROL的表达。其中,来源于内质网相关蛋白降解（endoplasmic reticulum associated degradation,ERAD）途径的Ubc1或Hrd1及参与蛋白分泌途径的Ssa4、Bmh2或Sso2等辅助蛋白使ROL的表达量提高达30-45%。分别将ERAD和分泌途径相关的不同辅助蛋白与ROL进行联合共表达,结果筛选到产酶性能最佳的克隆子GS115/5ROL-Hrd1-Ubc1 1#和GS115/5ROL-Ssa4-Sso2-Bmh2 4#,其酶活力分别达4750 U/mL和5230 U/mL。然后,以GS115/5ROL-Ssa4-Sso2-Bmh2 4#为出发菌,进一步分别共表达其它也能促进ROL表达的辅助蛋白,结果仅VHb与Ssa4、Bmh2和Sso2表现出协同促进作用,筛选到1株重组菌GS115/5ROL-Ssa4-Sso2-Bmh2-VHb 9#,摇瓶发酵酶活力达5650 U/mL,为起始菌GS115/pAOα-5ROL 11#的1.8倍,3-L高密度发酵126 h后ROL最高酶活力达41,700 U/mL。5.改进毕赤酵母基因敲除方法,敲除Gas1基因改变细胞壁通透性,提高ROL表达。改进了Pop-in/Pop-out法,使得反筛选过程中能同时利用正向筛选标记对目的基因缺陷型重组菌进行富集。与双交换法相比,运用改进的Pop-in/Pop-out法分别使Och1基因和Gas1基因的敲除成功率由0和20%提高到79%和近100%。使用改进的方法敲除了GS115/pAOα-5ROL 11#重组菌中Gas1基因,结果其酶活力由3080 U/mL增加到3900 U/mL,进一步联合共表达辅助蛋白Ssa4、Bmh2和Sso2,获得的重组菌的ROL酶活力提高至4630 U/mL。6.建立毕赤酵母基因连续无抗性整合方法,为重组ROL未来应用于食品、药品等领域奠定了方法学基础。基于改进的Pop-in/Pop-out法设计了一种基因无抗性整合方法,并以此分别尝试了lox71片段和ROL基因的无抗性整合,结果随机各挑选的3个重组菌中Zeocin抗生素基因等多余的DNA片段均被成功剔除。此外,基于Cre/loxP位点特异性重组系统,创建了一种基因连续无抗性整合的方法。通过交替使用66-R66型载体pZHCreAOX66-R66（ROL）和R71-71型载体pZHCreAOXR71-71（ROL）,成功实现了ROL基因的三轮无抗性整合。在每轮整合后筛选到的去除抗性的重组菌中,Cre基因、抗生素基因及冗余的His4基因等多余DNA片段以目的重组方式被剔除的阳性克隆子占40-67%。
谷洋[7]（2019）在《毕赤氏酵母中高效表达人血清白蛋白及基因编辑新技术的研究》文中指出人血清白蛋白是临床上具有重要应用的蛋白,但重组人血清白蛋白未能工业化生产,严重限制了它在临床上的供应。本课题开展人血清白蛋白高效表达和相关的毕赤酵母中基因编辑技术的研究具有重要的应用前景。本文首先将密码子优化后的人血清白蛋白基因通过同源重组技术,整合到毕赤酵母基因组的HIS4位点,构建了能表达重组人血清白蛋白的毕赤酵母菌株,初步优化了表达条件后摇瓶发酵产量在0.52 g/L。为能够利用代谢工程技术促进重组人血清白蛋白的工业化生产,进一步开展了建立高效的CRISPR/Cas9基因编辑系统的研究,以便后续能有效地对毕赤酵母进行系统改造。本文从质粒构建出发,在比较了五种毕赤酵母ARSs（PARS1,panARS,mitoARS,PpARS2和ScARS）的质粒转化效率、稳定性和拷贝数后,构建了 RNA pol Ⅲ启动子控制下的CRISPR/Cas9系统。这一新系统与以PARS 1为复制子的系统相比,编辑效率提高10倍,高达80%。本文继续将Cas9基因整合到基因组上,发现无论是RNA pol II启动子还是RNA pol Ⅲ启动子,只要使用毕赤酵母本身的启动子来表达sgRNA均能有较高的编辑效率。最终在毕赤酵母中,构建了基因敲除效率在80%以上而且基因整合效率在70%以上的CRISPR/Cas9基因组编辑新技术。总之,本论文构建成功了一个重组表达生产人血清白蛋白的毕赤酵母基因工程菌,并且进一步建立了更高效的CRISPR/Cas9基因组编辑新技术。这一更高效的基因组编辑技术的建立,将大大加快毕赤酵母基因组改造的效率,从而有利于提高包括人血清白蛋白在内的多种重要医用蛋白质的高效和高质量生产。
张照可[8]（2019）在《构建HSA-G4SRKDRRG4S-ONC的毕赤酵母工程菌及其表达产物的生物活性分析》文中研究表明近20年以来,现代生物技术快速发展并取得了一系列重大科技的进展和突破。尤其在医疗行业,基因工程制药的发展已经为人类的健康做出重大的贡献。其中,豹蛙抗瘤酶（ONC）是一种天然杀伤肿瘤细胞的核糖核酸酶。具有很强的肿瘤杀伤力,目前在很多体内外的肿瘤研究中得到了很好的进展,但临床试验中使用的豹蛙抗瘤酶均提取与蛙卵和早期胚胎中的天然提取物,来源有限,获取困难,产量相对较少,难以实现临床需求。另一方面,已知人血清白蛋白（HSA）具有有酵母高表达的特性。把ONC与HSA两者作用结合起来,制备出一种既高活性又高表达的融合蛋白,将产生巨大的社会效益以及促进医疗行业的进步。由此,本实验室研究组已经从构建了融合蛋白HSA-ONC中得到了高表达的融合蛋白HSA-ONC。为进一步的提高HSA-ONC的表达量、抗肿瘤活性和对肿瘤细胞的选择性,本文拟通过在HSA和ONC之间加上特定连接肽实现上述目标。本次实验是在已有融合蛋白连接肽（GGGGS）n基础上,插入本实验实构建的RKDRR序列片段,形成既有高度正负离子化又有高度亲水性的新型G4SRKDRRG4S连接肽。为了研究连接肽的作用,围绕构建表达融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC工程菌,表达融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC,分离纯化融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC,测定融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC的生物活性四个步骤展开实验,目的是达到不影响连接的两个蛋白活性的同时,又能保持甚至提高两个蛋白的表达量和对肿瘤细胞的选择性。在构建表达融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC工程菌时,利用本实验室构建的pPIC9K∕HSA和pPIC9K∕ONC重组质粒,用重叠PCR技术和阳性克隆筛选和鉴定构建重组（表达）质粒pPIC9K∕HSA-G4SRKDRRG4S-ONC及毕赤酵母工程菌GS115∕pPIC9K∕HSA-G4S RKDRRG4S-ONC,其次在表达融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC时,首先将GS115∕pPIC9K∕HSA-G4 SRKDRRG4S-ONC毕赤酵母工程菌进行扩大培养,进行诱导表达。诱导5d后,将发酵液离心,取上清按SDS-PAGE方法检测融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC的表达情况。然后在分离纯化融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC时,取含有融合蛋白HSA-G4SR KDRRG4S-ONC的发酵液上清进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,电泳结束后,根据目的蛋白在胶板中位置切下目的蛋白,匀浆,洗出目的蛋白,离心收集上清,真空冷冻干燥,得到融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC粉末,置于-80℃保存备用。最后在测定融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC的生物活性时,用0μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM、0.8μM、1μM、1.5μM、2μM浓度的融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC处理体外培养24h大鼠肝癌细胞CBRH-7919,用MTT显色法检测药物处理48h后的细胞活性,结果表明对大鼠肝癌细胞CBRH-7919的半致死量(IC50)为0.39±0.14μM。用流式检测细胞周期相的分布和凋亡率,结果表明经融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC处理过的大鼠肝癌细胞CBRH-7919,处于G0/G1期的细胞比例比对照组高,而处于S期和G2/M期的细胞比例开始减少,融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC处理组的细胞凋亡率较对照组明显增加;用Western Blot检测细胞内Caspas8、BAX蛋白的表达变化,结果促进细胞凋亡相关蛋白Caspas8、BAX表达上调,说明融合蛋白通过调节细胞凋亡相关蛋白表达抑制肝癌细胞活性。综上所述,本实验通过设计了G4SRKDRRG4S连接肽,分离纯化该融合蛋白HSA-G4SRKDRRG4S-ONC并检测其生物学作用,发现融合蛋白对大鼠肝癌细胞的毒性强于正常细胞,并且通过调节细胞凋亡相关蛋白表达抑制肝癌细胞活性。
郭跃东[9]（2019）在《构建HSA-G4SKNNNKG4S-ONC的毕赤酵母工程菌及其表达产物的生物活性分析》文中指出豹蛙抗瘤酶（ONC）是一种提取自豹蛙的卵细胞,又被称为两栖酶、抗肿瘤酶p30蛋白等,属于核糖核酸酶A的超家族成员,对于肿瘤细胞具有很强的杀伤力。但豹蛙抗瘤酶是一种天然的蛋白质,所以来源有限,产量极低,限制了其在临床上的广泛应用,该问题用基因工程方法得到了很好的解决。此外,人血清白蛋白（HSA）有着广泛的生物学作用,用基因工程方法制备高表达重组的HSA能够在医疗方面得到很高的利用价值。将ONC的抗肿瘤特性和HSA的生物学作用结合起来,制备出一种高活性和高表达特性的融合蛋白,无论是在医学和研究上都会获得巨大的影响力。所以,本实验室利用HSA的高表达的特点,通过对连接肽的构思和设计,构建了HSA-ONC融合蛋白,既满足了豹蛙抗瘤酶的生物学活性,又满足了对表达量的要求。为了能使融合蛋白成功表达,在柔性连接肽（GGGGS）n的基础上,加入KNNNK,形成具有高度正负离子化和高度亲水性的G4SKNNNKG4S连接肽,使融合蛋白的水溶性有所提高,从而达到蛋白的分离纯化更容易进行的目的,希望该连接肽既可以不影响它连接的两个蛋白的生物学活性,又有利于保持甚至提高两个蛋白的表达量和对肿瘤细胞的选择性。本实验利用实验室具有的重组质粒pPIC9K?HSA和pPIC9K?ONC,在融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC之间加入提前设计好的连接肽G4SKNNNKG4S。步骤为:首先设计引物,用重叠PCR技术完成HSA-G4SKNNNK G4S-ONC序列的合成,将合成的序列连接到扩增载体pMD20-T上,形成重组（扩增）的质粒pMD20-T?HSA-G4SKNNNKG4S-ONC。将重组质粒导入大肠杆菌DH5α中进行培养,然后进行阳性克隆筛选和鉴定,将正确的阳性菌进行扩大培养。提取（扩增）质粒,用扩增好的重组质粒pPIC9K?HSA-G4SKNNNKG4S-ONC导入大肠杆菌DH5α中培养,筛选出正确的菌株扩大进行培养。然后提取重组（表达）质粒导入GS115毕赤酵母细胞中,构建GS115?pPIC9K?HSA-G4SKNNNKG4S-ONC毕赤酵母工程菌,筛选出正确的阳性毕赤酵母工程菌GS115?pPIC9K?HSA-G4SKNNNKG4S-ONC,留作后续实验使用。将上述毕赤酵母工程菌GS115?pPIC9K?HSA-G4SKNNNKG4S-ONC扩大培养,然后通过发酵进行培养,用1%的甲醇诱导其表达,用5d的时间进行诱导,将发酵液离心后,通过SDS-PAGE方法检测上清液中的融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC的表达情况同时,对融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC进行分离纯化,将上清液中融合蛋白蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,分离胶浓度为10%,电压为90V,温度为4℃,得到目的蛋白,离心收集上清,真空冷冻干燥,得到融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC粉末,置于-80℃保存备用。然后检测融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC是否具有生物活性,具体方法为:准备好体外培养24h的大鼠肝癌细胞CBRH-7919,分别用0μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM、0.8μM、1μM、1.5μM、2μM不同浓度的融合蛋白进行处理,经过48h的处理后,用MTT显色法检测其细胞的活性,结果表明融合蛋白对大鼠肝癌细胞CBRH-7919的半致死量（IC50）为0.64±0.06μM,细胞的活性随着药物浓度的增加呈现逐渐减弱的趋势,并且表现出对浓度的依赖性。然后用流式检测细胞周期相的分布和凋亡率,结果表明经融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC处理过的大鼠肝癌细胞CBRH-7919,处于G0/G1期的细胞比例比对照组高,而处于S期和G2/M期的细胞比例开始减少,经过融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC处理过得细胞凋亡率与对照组相比明显增加,用Western Blot检测细胞内Caspas8、BAX蛋白的表达变化,结果促进细胞凋亡相关蛋白Caspas8、BAX表达上调,说明融合蛋白通过调节细胞凋亡相关蛋白表达来抑制肝癌细胞活性。综上所述,本文通过设计G4SKNNNKG4S连接肽,构建了重组（扩增）质粒pMD20-T?HSA-G4SKNNNKG4S-ONC、重组（表达）质粒pPIC9K?HSA-G4SKNNNKG4S-ONC和GS115?pPIC9K?HSA-G4SKNNNKG4S-ONC毕赤酵母工程菌,并且使融合蛋白HSA-G4SKNNNKG4S-ONC得到了成功的表达。分离纯化该蛋白并检测其生物学作用,发现融合蛋白对大鼠肝癌细胞通过调节细胞凋亡相关蛋白表达抑制肝癌细胞活性。
周利军[10]（2019）在《融合质粒HPV16E7-IL28B与IL7-IL15的构建及其在毕赤酵母系统中的表达》文中指出目的本实验通过构建pPIC9k-his-HPV16E7-IL-28B（Linker）及pPIC9k-IL-7-IL-15（Linker）分泌型重组表达质粒（以下简写为pPIC9k-E7-IL28B、pPIC9k-IL7-IL15）,转化毕赤酵母进行诱导表达,从而为研究其对宫颈癌的免疫治疗作用提供新的参考思路和依据奠定基础。方法1.根据毕赤酵母密码子使用频率表,利用OptimumGene软件对基因E7-IL28B进行密码子优化;2.运用分子克隆技术分别构建重组表达质粒载体pPIC9k-E7-IL28B及pPIC9k-IL7-IL15;将重组表达载体pPIC9k-E7-IL28B及pPIC9k-IL7-IL15电转化入P.pastoris GS115中并进行多拷贝转子筛选;3.探索甲醇浓度、诱导温度、诱导时间、培养基pH值等不同条件下融合蛋白pPIC9k-E7-IL28B及pPIC9k-IL7-IL15的表达情况,同时对这两种融合蛋白运用SDS-PAGE进行分析。结果成功构建重组表达质粒载体pPIC9k-E7-IL28B及pPIC9k-IL7-IL15,并通过遗传霉素（G418）筛选到高拷贝转化子;分别将筛选到的高拷贝转化子进行PCR验证,选取PCR阳性、测序正确的菌株进行融合蛋白诱导表达。经过发酵条件优化,分别找出了适合融合蛋白E7-IL28B、IL7-IL15的最佳诱导条件。在甲醇浓度为1%、29℃、230rpm、pH值为6.0、诱导96 h的时候经过基因优化的融合蛋白E7-IL28B得到了表达;在甲醇浓度为1%、29℃、230 rpm、pH值为6.0、诱导120 h的时候融合蛋白IL7-IL15表达量较高。结论1.成功构建毕赤酵母表达载体pPIC9k-HPV16E7-IL-28B及pPIC9k-IL7-IL15,分别将其基因序列整合到毕赤酵母的基因组里;2.密码子优化策略促进了融合蛋白E7-IL28B在毕赤酵母系统中的表达;3.在其它诱导条件相同的情况下,在甲醇浓度为1%的时候融合蛋白IL7-IL15的表达量最高。
二、重组人血清白蛋白在Pichia pastoris中的表达与纯化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组人血清白蛋白在Pichia pastoris中的表达与纯化（论文提纲范文）
（1）基于蛋白质的智能型抗肿瘤药物纳米递送系统的设计及性能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 纳米药物递送系统概述 |
| 1.1.1 无机类纳米递药系统 |
| 1.1.2 合成高分子类纳米递药系统 |
| 1.1.3 天然高分子类纳米递药系统 |
| 1.1.4 生物大分子类纳米递药系统 |
| 1.2 基于肿瘤微环境的药物递送系统 |
| 1.2.1 肿瘤微环境 |
| 1.2.2 肿瘤微环境响应型药物递送系统 |
| 1.3 本论文的研究思路和内容 |
| 1.3.1 纳米药物递送系统面临的科学问题 |
| 1.3.2 本论文的主要研究内容 |
| 第二章 细胞外基质成分包裹的双酶响应型递药系统的制备及性能研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 细胞及动物 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 双酶响应型纳米粒的制备及体外表征 |
| 2.3.1 双酶响应型介孔二氧化硅纳米粒的制备 |
| 2.3.2 双酶响应型纳米粒的体外表征测定 |
| 2.3.3 双酶响应型纳米粒载药量测定 |
| 2.3.4 双酶响应型纳米粒体外药物释放评价 |
| 2.3.5 双酶响应型纳米粒体外蛋白吸附实验 |
| 2.4 细胞实验 |
| 2.4.1 细胞培养 |
| 2.4.2 双酶响应型纳米粒细胞毒性研究 |
| 2.4.3 双酶响应型纳米粒体外细胞摄取情况 |
| 2.5 动物实验 |
| 2.5.1 构建荷瘤小鼠肿瘤模型 |
| 2.5.2 双酶响应型纳米粒体内生物分布研究 |
| 2.5.3 双酶响应型纳米粒抑制肿瘤效果评价 |
| 2.6 结果与讨论 |
| 2.6.1 双酶响应型纳米粒体外实验表征 |
| 2.6.2 双酶响应型纳米粒细胞实验表征 |
| 2.6.3 双酶响应型纳米粒动物实验表征 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 基于融合白蛋白的多功能递药系统的构建及性能研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 动物、菌株、质粒和细胞 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.3 多功能融合白蛋白的构建及纳米粒的体外表征 |
| 3.3.1 培养基与相关溶液的配置 |
| 3.3.2 多功能融合白蛋白的表达与纯化 |
| 3.3.3 多功能融合白蛋白验证 |
| 3.3.4 多功能融合白蛋白纳米粒酶响应性评价 |
| 3.3.5 多功能融合白蛋白纳米粒载药量测定 |
| 3.3.6 多功能融合白蛋白纳米粒形貌表征 |
| 3.3.7 多功能融合白蛋白纳米粒体外药物释放实验 |
| 3.4 细胞实验 |
| 3.4.1 细胞培养 |
| 3.4.2 多功能融合白蛋白纳米粒细胞毒性及凋亡实验 |
| 3.4.3 多功能融合白蛋白纳米粒细胞摄取情况 |
| 3.5 动物实验 |
| 3.5.1 构建荷瘤小鼠模型 |
| 3.5.2 多功能融合白蛋白纳米粒体内生物分布评价 |
| 3.5.3 多功能融合白蛋白纳米粒药代动力学实验 |
| 3.5.4 多功能融合白蛋白纳米粒体内抗肿瘤效果评价 |
| 3.5.5 多功能融合白蛋白纳米粒安全性评估 |
| 3.6 结果与讨论 |
| 3.6.1 多功能融合白蛋白的验证 |
| 3.6.2 多功能融合白蛋白纳米粒的靶向性验证 |
| 3.6.3 多功能融合白蛋白纳米粒的酶响应性验证 |
| 3.6.4 多功能融合白蛋白纳米粒的p H响应性验证 |
| 3.6.5 多功能融合白蛋白纳米粒的细胞毒性评价 |
| 3.6.6 多功能融合白蛋白纳米粒的体内抗肿瘤及安全性评价 |
| 3.7 本章小结 |
| 第四章 化药-光热协同治疗的多功能融合蛋白纳米粒的制备及性能研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 动物和细胞 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.3 协同治疗融合蛋白的构建及纳米粒的体外表征 |
| 4.3.1 培养基与相关溶液的配置 |
| 4.3.2 融合蛋白的表达、纯化及验证 |
| 4.3.3 融合蛋白包载金纳米粒最佳反应时间、浓度探索 |
| 4.3.4 协同治疗融合蛋白纳米粒载药曲线测定 |
| 4.3.5 协同治疗融合蛋白纳米粒形貌观察 |
| 4.3.6 协同治疗融合蛋白纳米粒体外药物释放评估 |
| 4.3.7 协同治疗纳米粒体外光热效应评估 |
| 4.4 细胞实验 |
| 4.4.1 细胞培养 |
| 4.4.2 协同治疗融合蛋白细胞毒性评价 |
| 4.4.3 协同治疗融合蛋白纳米粒细胞摄取情况 |
| 4.5 动物实验 |
| 4.5.1 构建荷瘤小鼠模型 |
| 4.5.2 协同治疗融合蛋白纳米粒药物分布情况 |
| 4.5.3 协同治疗融合蛋白纳米粒抗肿瘤效果评价 |
| 4.6 结果与讨论 |
| 4.6.1 协同治疗融合蛋白各组分验证 |
| 4.6.2 协同治疗融合蛋白纳米粒载药曲线分析 |
| 4.6.3 协同治疗融合蛋白纳米粒的靶向性验证 |
| 4.6.4 协同治疗融合蛋白纳米粒的酶响应性验证 |
| 4.6.5 协同治疗融合蛋白纳米粒的p H响应性验证 |
| 4.6.6 协同治疗融合蛋白纳米粒的光热效应评价 |
| 4.6.7 协同治疗融合蛋白纳米粒的细胞毒性评价 |
| 4.6.8 协同治疗融合蛋白纳米粒的组织分布及抑瘤效果评价 |
| 4.6.9 协同治疗纳米粒与多西他赛溶液生存期评估 |
| 4.7 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
| 附录 Ⅱ:关键引物表 |
（2）微生物高效表达异源豆血红蛋白的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 豆血红蛋白概述 |
| 1.3 大肠杆菌表达系统简介 |
| 1.4 毕赤酵母表达系统简介 |
| 1.5 Gibson重组 |
| 1.6 本课题的研究思路和研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 菌株与质粒 |
| 2.2 仪器与试剂 |
| 2.3 培养基 |
| 2.4 溶液配方 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.6 分析方法 |
| 第三章 豆血红蛋白在大肠杆菌中的重组表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 豆血红蛋白在毕赤酵母中的重组表达 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 重组毕赤酵母摇瓶发酵优化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 分析测定方法 |
| 5.5 结果与讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（3）采用融合白蛋白结合域和FcRn结合域改善CD47纳米抗体体内代谢动力学（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 延长小分子蛋白药物体内代谢策略的研究进展 |
| 1 引言 |
| 2 影响小分子蛋白药物半衰期的因素 |
| 3 延长小分子蛋白药物半衰期的策略 |
| 3.1 增加蛋白质流体动力学半径 |
| 3.2 FcRn介导的再循环 |
| 4.本研究的目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第二章 重组抗CD47纳米抗体的制备和鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌种及质粒 |
| 1.2 试剂与抗体 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 重组表达载体的构建 |
| 2.2 重组抗体的小量诱导表达及鉴定 |
| 2.3 重组抗体的纯化及鉴定(以 3D3-2-ABD 为例) |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 重组表达载体的构建 |
| 3.2 重组纳米抗体的表达及鉴定 |
| 3.3 重组纳米抗体的大量诱导表达及纯化和鉴定 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 重组抗CD47纳米抗体的抗原结合活性检测及半衰期测定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 试剂与抗体 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 重组纳米抗体的体外活性检测 |
| 2.2 重组纳米抗体的体内血浆半衰期检测 |
| 2.3 重组纳米抗体的免疫原性检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组纳米抗体体外活性检测 |
| 3.2 重组纳米抗体的体内血浆半衰期检测 |
| 3.3 重组纳米抗体的免疫原性检测 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）重组人血清白蛋白的发酵及纯化工艺研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写说明 |
| 1 绪论 |
| 1.1 人血清白蛋白 |
| 1.1.1 人血清白蛋白的理化性质及机理功能 |
| 1.1.2 人血清白蛋白的应用及市场前景 |
| 1.2 重组人血清白蛋白的分离纯化 |
| 1.2.1 重组人血清白蛋白的表达 |
| 1.2.2 重组人血清白蛋白的分离纯化 |
| 1.3 课题研究的内容和意义 |
| 2 重组人血清白蛋白发酵条件的优化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 实验试剂、溶液与培养基 |
| 2.1.3 实验仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 BMGY与 BSM培养基罐上发酵的对比 |
| 2.2.2 BSM培养基配方的优化 |
| 2.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 BMGY与 BSM培养基罐上发酵的对比 |
| 2.3.2 BSM培养基配方的优化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 重组人血清白蛋白的纯化-蓝胶亲和层析,疏水层析和ConA亲和层析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验试剂与溶液 |
| 3.1.2 实验仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 发酵上清液的预处理 |
| 3.2.2 Blue Sepharose亲和层析 |
| 3.2.3 Phenyl Sepharose疏水层析 |
| 3.2.4 HPLC法鉴定产物纯度 |
| 3.2.5 ConA亲和层析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 预处理 |
| 3.3.2 Blue Sepharose亲和层析 |
| 3.3.3 Phenyl Sepharose疏水层析 |
| 3.3.4 HPLC检测目的蛋白纯度 |
| 3.3.5 ConA亲和层析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 重组人血清白蛋白的进一步纯化-免疫亲和层析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物及细胞 |
| 4.1.2 实验试剂与溶液 |
| 4.1.3 实验仪器与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 人血清白蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 |
| 4.2.2 抗体制备 |
| 4.2.3 免疫亲和层析柱的制备 |
| 4.2.4 免疫亲和层析 |
| 4.2.5 间接ELISA法测抗体效价 |
| 4.2.6 免疫印迹法检测抗体特异性 |
| 4.2.7 HPLC检测目的蛋白纯度 |
| 4.2.8 酵母宿主蛋白的检测 |
| 4.2.9 白蛋白最终纯度的计算 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 人血清白蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 |
| 4.3.2 抗体制备 |
| 4.3.3 免疫亲和层析 |
| 4.3.4 HPLC检测白蛋白纯度 |
| 4.3.5 酵母宿主蛋白的检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 创新性分析 |
| 对进一步研究工作的设想和建议 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及专利申请 |
| 致谢 |
（5）人血白蛋白的分离配基设计和重组人血白蛋白分离研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 绪论 |
| 1.2 人血白蛋白的结构、功能及用途 |
| 1.2.1 人血白蛋白的结构 |
| 1.2.2 人血白蛋白的功能 |
| 1.2.3 人血白蛋白的用途 |
| 1.3 重组人血白蛋白的表达及分离纯化 |
| 1.3.1 重组人血白蛋白的表达 |
| 1.3.2 重组人血白蛋白的分离纯化 |
| 1.4 分子模拟及其应用 |
| 1.4.1 分子对接 |
| 1.4.2 分子动力学模拟 |
| 1.4.3 分子模拟在蛋白-配基结合机理研究中的应用 |
| 1.4.4 分子模拟在配基设计中的应用 |
| 1.5 本文研究思路 |
| 第二章 人血白蛋白的分离配基设计与分子模拟 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 分子模拟软件与方法 |
| 2.2.1 主要软件 |
| 2.2.2 分子对接 |
| 2.2.3 分子动力学模拟 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 基于L-色氨酸的人血白蛋白配基设计 |
| 2.3.2 设计配基与人血白蛋白的分子对接 |
| 2.3.3 设计配基与人血白蛋白的分子动力学模拟 |
| 2.3.4 新型配基设计及分子模拟 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 IAA-CYS介质制备及HSA结合机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂与仪器 |
| 3.2.2 IAA-CYS介质制备 |
| 3.2.3 分析方法 |
| 3.2.4 竞争性吸附 |
| 3.2.5 IAA-CYS-空间臂与人血白蛋白的分子模拟 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 IAA-CYS介质及竞争性结合实验 |
| 3.3.2 IAA-CYS-空间臂与HSA结合的分子模拟 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 IAA-CYS介质的吸附性能及rHSA分离 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要试剂与仪器 |
| 4.2.2 HSA静态吸附 |
| 4.2.3 HSA吸附等温线 |
| 4.2.4 HSA动态载量测定 |
| 4.2.5 毕赤酵母发酵液预处理 |
| 4.2.6 rHSA动态载量测定 |
| 4.2.7 洗脱条件优化 |
| 4.2.8 酵母发酵液中分离rHSA |
| 4.2.9 SDS-PAGE分析 |
| 4.2.10 SEC-HPLC分析 |
| 4.2.11 ELISA分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 HSA静态吸附 |
| 4.3.2 HSA吸附等温线 |
| 4.3.3 HSA动态载量 |
| 4.3.4 rHSA动态载量 |
| 4.3.5 洗脱条件优化 |
| 4.3.6 酵母发酵液中分离rHSA |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（6）毕赤酵母分子操作方法改进及其在米根霉脂肪酶高效表达中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 脂肪酶概述 |
| 1.2 米根霉脂肪酶的研究进展 |
| 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统 |
| 1.4 研究背景及意义 |
| 2 影响米根霉脂肪酶在毕赤酵母中高效表达的关键因子探索 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论与小结 |
| 3 探索PTVA法实现毕赤酵母基因拷贝数增加的机制 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论与小结 |
| 4 优化基因拷贝数提高ROL在毕赤酵母中的表达水平 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论与小结 |
| 5 共表达辅助蛋白进一步增强ROL在重组菌中的表达 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 讨论与小结 |
| 6 面向食品医药的新型毕赤酵母基因操作方法探索与开发 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.3 讨论与小结 |
| 7 全文总结与展望 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 展望 |
| 主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读博士研究生期间发表的学术成果 |
| 附录2 基因序列 |
| 附录3 各种仪器与设备 |
（7）毕赤氏酵母中高效表达人血清白蛋白及基因编辑新技术的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 人血清白蛋白概述 |
| 1.2.1 人血清白蛋白的结构与性质 |
| 1.2.2 人血清白蛋白的合成 |
| 1.2.3 人血清白蛋的生理功能 |
| 1.3 重组人血清白蛋的生产现状 |
| 1.4 毕赤酵母表达系统 |
| 1.4.1 基因拷贝数对产量的影响 |
| 1.4.2 启动子对产量的影响 |
| 1.4.3 蛋白修饰和分泌能力对产量的影响 |
| 1.5 毕赤酵母质粒复制子 |
| 1.6 毕赤酵母基因工程工具 |
| 1.6.1 传统基因编辑技术 |
| 1.6.2 新型基因组编辑技术 |
| 1.6.3 Golden gate |
| 1.6.4 Gibson重组 |
| 1.7 本课题研究意义及研究计划 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 菌株与质粒 |
| 2.2 仪器与试剂 |
| 2.2.1 主要仪器与设备 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.3 培养基与试剂配制 |
| 2.3.1 培养基 |
| 2.3.2 生化试剂 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 大肠杆菌化学感受态制备 |
| 2.4.2 大肠杆菌感受态化学转化 |
| 2.4.3 毕赤酵母电转感受态制备 |
| 2.4.4 毕赤酵母电转化 |
| 2.4.5 大肠杆菌质粒提取 |
| 2.4.6 毕赤酵母质粒提取 |
| 2.4.7 毕赤酵母全基因组提取 |
| 2.4.8 毕赤酵母菌落PCR验证 |
| 2.4.9 大肠杆菌菌落PCR验证 |
| 第三章 产人血清白蛋白毕赤酵母菌株的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 人血清白蛋白表达质粒构建 |
| 3.2.3 产人血清白蛋白菌株构建 |
| 3.2.4 摇瓶上表达重组人血清白蛋白 |
| 3.2.5 蛋白电泳分析白蛋白表达情况 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 白蛋白表达质粒构建 |
| 3.3.2 HSA诱导表达 |
| 3.3.3 甲醇诱导浓度确定 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 毕赤酵母复制子特性比较及在CRISPR/Cas9系统构建中的应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 带有不同复制子的荧光蛋白表达质粒和菌株构建 |
| 4.2.3 蛋白表达强度和质粒稳定性测定 |
| 4.2.4 qPCR测定质粒拷贝数 |
| 4.2.5 单质粒CRISPR系统构建 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 荧光蛋白表达质粒构建 |
| 4.3.2 不同复制子对转化效率的影响 |
| 4.3.3 不同复制子对蛋白表达强度的影响 |
| 4.3.4 不同复制子对质粒拷贝数的影响 |
| 4.3.5 不同复制子对质粒稳定性的影响 |
| 4.3.6 不同复制子对CRISPR/Cas9敲除效率的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 毕赤酵母高效CRISPR/Cas9系统构建 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株和质粒 |
| 5.2.2 整合型hCas9蛋白表达质粒和菌株的构建 |
| 5.2.3 RNA pol Ⅲ启动子和RNA pol Ⅱ启动子控制的sgRNA质粒构建 |
| 5.2.4 多个sgRNA串联质粒构建 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 hCas9整合表达质粒和菌株的构建 |
| 5.3.2 hCas9整合到基因组上CRISPR/Cas9编辑效率 |
| 5.3.3 不同长度同源臂的选择对敲除效率的影响 |
| 5.3.4 不同sgRNA和基因靶点的选择对基因编辑效率的影响 |
| 5.3.5 多重基因同时敲除效率 |
| 5.3.6 基因整合效率 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（8）构建HSA-G4SRKDRRG4S-ONC的毕赤酵母工程菌及其表达产物的生物活性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 融合蛋白中人血清白蛋白(HSA)的作用研究 |
| 1.1.1 人血清白蛋白(HSA)的结构 |
| 1.1.2 人血清白蛋白(HSA)的应用 |
| 1.2 融合蛋白中豹蛙抗瘤酶(ONC)的发展现状 |
| 1.2.1 豹蛙抗瘤酶(ONC)的结构 |
| 1.2.2 豹蛙抗瘤酶(ONC)的作用机理 |
| 1.2.3 豹蛙抗瘤酶(ONC)的前景展望 |
| 1.3 连接肽的研究现状与应用 |
| 1.3.1 连接肽的分类及特点 |
| 1.3.2 重组连接肽的功能 |
| 1.3.3 重组连接肽的设计原理 |
| 1.4 融合蛋白的特点与应用 |
| 1.4.1 融合蛋白的特点 |
| 1.4.2 融合蛋白的应用 |
| 1.5 研究目的、意义和内容 |
| 1.5.1 研究目的与意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 实验材料及试剂 |
| 2.1 构建融合蛋白HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC毕赤酵母工程菌的材料与试剂 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 融合蛋白HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC的表达与分离纯化的材料与试剂 |
| 2.2.1 主要材料 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 融合蛋白HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC对细胞活性的分析及其机理的材料与试剂 |
| 2.3.1 主要材料 |
| 2.3.2 主要试剂 |
| 第三章 构建融合蛋白HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC毕赤酵母工程菌的实验方法 |
| 3.1 试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重组质粒HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC的构建技术路线 |
| 3.2.2 引物设计 |
| 3.2.3 目的基因HSA的扩增与回收 |
| 3.2.4 目的基因ONC的扩增与回收 |
| 3.2.5 融合蛋白基因HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC的扩增和回收 |
| 3.2.6 pMD20-T/HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC重组(扩增)质粒的构建和鉴定 |
| 3.2.7 pPIC9K/HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC重组(表达)质粒的构建和鉴定 |
| 3.2.8 pPIC9K/HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC毕赤酵母工程菌的构建、筛选与鉴定 |
| 第四章 融合蛋白HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC的表达与分离纯化的实验方法 |
| 4.1 试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 重组蛋白HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC的诱导表达 |
| 4.2.2 重组蛋白HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC的鉴定:SDS-PAGE电泳 |
| 4.2.3 融合蛋白HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC的分离纯化 |
| 第五章 融合蛋白HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC对细胞活性的分析及其机理的实验方法 |
| 5.1 试剂配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 大鼠肝癌细胞CBRH-7919 的培养 |
| 5.2.2 细胞活性检测:MTT显色 |
| 5.2.3 流式细胞术(Flow-Cytometry) |
| 5.2.4 蛋白免疫印迹(Western Blot) |
| 第六章 实验结果与分析 |
| 6.1 构建融合蛋白HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC毕赤酵母工程菌的实验结果与分析 |
| 6.1.1 扩增与回收目的基因HSA |
| 6.1.2 扩增与回收目的基因ONC |
| 6.1.3 扩增与回收的融合蛋白基因HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC |
| 6.1.4 鉴定的p MD20-T∕HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC重组(扩增)质粒 |
| 6.1.5 构建的p PIC9K/HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC重组(表达)质粒 |
| 6.1.6 筛选与鉴定的pPIC9K/HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC重组(表达)质粒 |
| 6.1.7 鉴定的GS115∕pPIC9K/HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC毕赤酵母工程菌株 |
| 6.2 融合蛋白HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC的表达与分离纯化的实验结果与分析 |
| 6.2.1 重组酵母菌GS115 诱导表达融合蛋白HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC的鉴定 |
| 6.2.2 检测分离纯化的融合蛋白HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC |
| 6.3 融合蛋白HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC对细胞活性的分析及其机理的实验结果与分析 |
| 6.3.1 融合蛋白HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC对细胞活性的影响 |
| 6.3.2 融合蛋白HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC对细胞凋亡的影响 |
| 6.3.3 融合蛋白HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC对细胞周期的影响 |
| 6.3.4 融合蛋白HSA-G_4SRKDRRG_4S-ONC对细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 |
（9）构建HSA-G4SKNNNKG4S-ONC的毕赤酵母工程菌及其表达产物的生物活性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 融合蛋白的设计策略及其应用 |
| 1.1.1 融合蛋白的特点 |
| 1.1.2 融合蛋白的设计策略 |
| 1.1.3 融合蛋白的应用 |
| 1.2 人血清白蛋白(HSA)的研究现状 |
| 1.2.1 人血清白蛋白(HSA)的结构特点 |
| 1.2.2 人血清白蛋白(HSA)的理化性质及生理功能 |
| 1.2.3 人血清白蛋白(HSA)的临床应用 |
| 1.3 豹蛙抗瘤酶(ONC)的作用研究 |
| 1.3.1 豹蛙抗瘤酶的结构 |
| 1.3.2 豹蛙抗瘤酶(ONC)的作用机理 |
| 1.3.3 豹蛙抗瘤酶的前景展望 |
| 1.4 研究目的和内容 |
| 1.4.1 研究目的 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 构建融合蛋白HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC的材料与方法 |
| 2.1 主要材料 |
| 2.2 主要试剂及配置 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 引物设计 |
| 2.3.2 重组质粒HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC的构建方案 |
| 2.3.3 目的基因的扩增与回收 |
| 2.3.4 融合蛋白基因HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC的扩增和回收 |
| 2.3.5 重组(扩增)HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC质粒的构建与鉴定 |
| 2.3.6 重组(表达)pPIC9K/HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC质粒的构建与鉴定 |
| 2.3.7 pPIC9K/HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC毕赤酵母工程菌的构建与鉴定 |
| 第三章 融合蛋白HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC的表达与分离纯化 |
| 3.1 主要材料 |
| 3.2 主要试剂 |
| 3.3 重组蛋白HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC的诱导表达 |
| 3.4 SDS-PAGE电泳 |
| 3.5 融合蛋白HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC的分离纯化 |
| 第四章 实验结果与分析 |
| 4.1 目的基因的扩增与回收结果 |
| 4.2 融合蛋白HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC的扩增和回收结果 |
| 4.3 重组(扩增)HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC质粒的结果 |
| 4.4 重组(表达)质粒pPIC9K/HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC构建结果 |
| 4.5 重组(表达)质粒pPIC9K/HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC筛选与鉴定的结果 |
| 4.6 pPIC9K/HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC毕赤酵母工程菌的构建与鉴定 |
| 4.7 融合蛋白HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC的分离纯化 |
| 4.7.1 重组酵母菌GS115 诱导表达融合蛋白HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC |
| 4.7.2 分离纯化融合蛋白HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC |
| 第五章 融合蛋白HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC对细胞活性的分析及其机理 |
| 5.1 主要材料 |
| 5.2 主要试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 大鼠肝癌细胞CBRH-7919 的培养 |
| 5.3.2 细胞活性检测:MTT显色 |
| 5.3.3 Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测法 |
| 5.3.4 流式细胞术(Flow-Cytometry)检测细胞周期 |
| 5.3.5 蛋白免疫印迹(Western Blot) |
| 5.4 实验结果与分析 |
| 5.4.1 融合蛋白HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC对细胞活性的影响 |
| 5.4.2 融合蛋白HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC对细胞凋亡的影响 |
| 5.4.3 融合蛋白HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC对细胞周期的影响 |
| 5.4.4 融合蛋白HSA-G_4SKNNNKG_4S-ONC对细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 总结与结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 |
（10）融合质粒HPV16E7-IL28B与IL7-IL15的构建及其在毕赤酵母系统中的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词语对照表 |
| 1 前言 |
| 1.1 宫颈癌免疫治疗前景 |
| 1.2 IL-28B、IL-7与IL-15 抗肿瘤免疫治疗作用的研究 |
| 1.2.1 IL-28B与肿瘤免疫治疗 |
| 1.2.2 IL-7与IL-15 在肿瘤免疫治疗中的研究现状 |
| 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统 |
| 1.4 本课题的研究内容、创新性及意义 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒及菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 实验试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 HPV16E7、IL-28B基因序列 |
| 2.2.2 重组表达质粒的构建 |
| 2.2.3 重组表达载体质粒鉴定 |
| 2.2.4 重组质粒转化毕赤酵母感受态细胞 |
| 2.2.5 两种融合蛋白在毕赤酵母中的表达 |
| 2.2.6 表达产物的SDS-PAGE电泳检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 pPIC9K-E7-IL28B的构建、表达及分析鉴定 |
| 3.1.1 融合基因E7-IL28B密码子优化 |
| 3.1.2 PCR扩增目的基因及重组质粒载体鉴定 |
| 3.1.3 重组质粒pPIC9K-E7-IL28B线性化 |
| 3.1.4 重组质粒pPIC9K-E7-IL28B整合到P.pastoris GS115后PCR鉴定 |
| 3.1.5 融合基因E7-IL28B优化前后在P.pastoris GS115 中的表达 |
| 3.2 pPIC9K-IL7-IL15 的构建、表达及分析鉴定 |
| 3.2.1 PCR扩增目的基因及重组质粒载体鉴定 |
| 3.2.2 重组质粒载体pPIC9K-IL7-IL15 线性化 |
| 3.2.3 重组质粒pPIC9K-IL7-IL15 整合到P.pastoris GS115后PCR鉴定 |
| 3.2.4 融合基因IL7-IL15在P.pastoris GS115 中的表达 |
| 3.3 小结 |
| 4 讨论 |
| 5 结语 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 问题及后续实验计划安排 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 宫颈癌免疫治疗与应用展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 发表的学术论文 |
| 研究生学习期间参研课题 |
四、重组人血清白蛋白在Pichia pastoris中的表达与纯化（论文参考文献）
- [1]基于蛋白质的智能型抗肿瘤药物纳米递送系统的设计及性能研究[D]. 王明宇. 江南大学, 2021(01)
- [2]微生物高效表达异源豆血红蛋白的研究[D]. 苏悦. 浙江大学, 2020(05)
- [3]采用融合白蛋白结合域和FcRn结合域改善CD47纳米抗体体内代谢动力学[D]. 高晓娟. 新疆大学, 2020(07)
- [4]重组人血清白蛋白的发酵及纯化工艺研究[D]. 许人仁. 中国医药工业研究总院, 2020(06)
- [5]人血白蛋白的分离配基设计和重组人血白蛋白分离研究[D]. 葛程童. 浙江大学, 2020
- [6]毕赤酵母分子操作方法改进及其在米根霉脂肪酶高效表达中的应用[D]. 焦梁成. 华中科技大学, 2019
- [7]毕赤氏酵母中高效表达人血清白蛋白及基因编辑新技术的研究[D]. 谷洋. 浙江大学, 2019(03)
- [8]构建HSA-G4SRKDRRG4S-ONC的毕赤酵母工程菌及其表达产物的生物活性分析[D]. 张照可. 河南师范大学, 2019(07)
- [9]构建HSA-G4SKNNNKG4S-ONC的毕赤酵母工程菌及其表达产物的生物活性分析[D]. 郭跃东. 河南师范大学, 2019(07)
- [10]融合质粒HPV16E7-IL28B与IL7-IL15的构建及其在毕赤酵母系统中的表达[D]. 周利军. 甘肃中医药大学, 2019(03)