一、超抗原SED突变体的构建表达和鉴定（论文文献综述）
王铜,陶晓霞,郭敏卓,孟凡亮,王多,张建中,王国庆,闫笑梅[1]（2020）在《金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SED序列多态性及进化分析》文中研究说明目的对不同来源金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC和SED的序列多态性及进化进行分析,为进一步了解不同亚型的毒素表达差异及食品风险评估提供理论依据。方法选择我国部分地区不同来源经典肠毒素SEA、SEB、SEC和SED阳性的菌株共90株,采用PCR方法扩增其序列并测序。并与GenBank下载的经典肠毒素亚型代表序列进行比对分析,用MEGA 7软件构建系统发生树。结果 SEA氨基酸序列存在3个突变位点,主要位于N端和C端;有3个亚型,SEA阳性菌株以SEA1亚型为主。SEB氨基酸序列在两端的突变较中间活跃,存在18个突变位点;有11个亚型,SEB阳性菌株主要为SEB1和SEB2亚型。SEC氨基酸序列突变位点有24个,分布在整个序列;共8个亚型,SEC阳性菌株以SEC3亚型为主。SED氨基酸序列相对保守,共7个亚型,SED阳性菌株以SED1为主。本研究还发现2个新亚型,分别命名为SEB9和SEC5,均来自患者分离菌株。结论 SEA和SED的氨基酸序列较为保守,SEB和SEC的氨基酸突变位点较多。4种肠毒素的氨基酸序列进化树均分为2个分支。本研究选取的菌株以SEA1、SEB1、SEB2、SEC3和SED1亚型为主。
孙世杰[2]（2020）在《超抗原与人TCR-CD3复合物的相互作用研究》文中进行了进一步梳理超抗原将抗原呈递细胞上的MHC Ⅱ类与TCR交联并激活大部分T细胞群,能够引起大比例的免疫反应。超抗原通过同时结合MHC Ⅱ和T细胞上的T细胞受体引起大量T细胞增殖。我们需要深化探究超抗原和T细胞的相互作用,这将帮助我们研究淋巴细胞对于自身抗原免疫耐受的机理。本文通过分别表达和纯化超抗原SEA和SEH、人源αβTCR/CD3复合物和p MHC蛋白再相互结合来研究超抗原与人源αβTCR/CD3复合物和p MHC的相互作用。首先,将超抗原SEA和SEH的基因片段分别插入到p ET-21a（+）质粒中,使其在大肠杆菌中表达;将同一种αβTCR的α、β亚基插入到同一个p EB6质粒中,将CD3的δ、ε、γ、ζ四个亚基插入到同一个pc DNA3.1质粒中,然后使其在哺乳动物细胞中表达;将pMHC Ⅱ基因片段插入到p Fast Bac Dual质粒中,使其在昆虫细胞中表达。之后通过亲和层析富集蛋白,再通过分子筛分离蛋白,并将纯化后的蛋白用于相互作用研究。首先,我们探究了超抗原与αβTCR/CD3复合物两者的相互作用,然后进行了超抗原、αβTCR/CD3复合物和p MHC蛋白三者的相互作用。最后,我们探讨了交联剂和Zn2+浓度对超抗原、αβTCR/CD3复合物和p MHC相互作用的影响。实验结果发现,超抗原SEA和SEH在原核表达系统中表达较为理想;人源的αβTCR/CD3复合物在哺乳动物细胞中的表达量较低,难以获得大量的蛋白;通过优化条件后p MHC在昆虫细胞中能够获得足够使用的蛋白。超抗原与αβTCR/CD3及对应的p MHC的相互作用研究中发现,SEH与2IAL TCR/CD3及p MHC的结合较好,可以用于透射电镜观察;交联剂可以提高形成的复合物产量但可能会使得复合物的形态发生变化从而会影响实验结果的分析。
刘圆圆[3]（2020）在《金黄色葡萄球菌肠毒素B人源性单克隆抗体的生物学特性研究》文中研究指明研究背景:金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,以下简称金葡菌）是全世界医院和社区获得性感染的主要病原体,对医疗保健系统构成了巨大负担。葡萄球菌肠毒素B（Staphylococcal enterotoxin B,SEB）是金葡菌感染致病的主要因子之一。作为超抗原,SEB与主要组织相容性复合体的Ⅱ类分子（MHCⅡ）和T细胞受体（TCR）的特定Vβ区域结合,扰乱免疫系统,激活单核/巨噬细胞和T淋巴细胞并诱导高水平的促炎细胞因子、趋化因子、组织因子、裂解酶和活性氧,激活炎症和凝血途径,从而导致内皮细胞损伤、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征和中毒性休克综合征。此外,SEB常与伴有呕吐、腹痛、腹泻等症状的食物中毒有关。作为具有气溶胶稳定性的致死性和致残剂,SEB是一种明确的细菌毒素类生物战剂。至今还没有批准用于治疗SEB诱发疾病的疫苗或特效药物。目前的研究涉及多种治疗方向,比如针对SEB的疫苗或治疗性抗体、细胞受体与毒素相互作用的抑制剂、信号转导和细胞因子诱导抑制剂。能尽快中和毒素、发挥治疗作用的高亲和力抗体是抗生素和疫苗的重要支撑和补充,可能是治疗紧急干预相关感染的最佳方法和无法接种疫苗的免疫缺陷患者的最佳选择。前期采用单个B细胞技术筛选得到的SEB人源性单克隆抗体（Monoclonal antibody,mAb）M0313代表着一种预防和治疗SEB疾病的潜在免疫疗法。本研究通过检测抗体mAb M0313体外对SEB中和作用,体内对SEB诱发中毒性休克、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）诱发脓毒血症的保护作用,鉴定中和SEB活性的B细胞表位,评价mAb M0313作为针对SEB诱发疾病治疗用抗体制剂的可能性。研究目的:评价mAb M0313的体外结合及中和活性、体内针对SEB及MRSA菌株的免疫保护效果,鉴定其识别SEB的免疫优势表位,为研发针对SEB诱发疾病和金葡菌感染的治疗用抗体制剂奠定实验基础。研究方法:1.mAb M0313的表达及鉴定。将构建的mAb M0313重链和轻链重组质粒瞬时转染HEK 293F细胞,表达并纯化mAb M0313,采用ELISA、WB和BLI评价mAb M0313与野生型金葡菌肠毒素B（Wild type Staphylococcal enterotoxin B,wSEB,以下称SEB）、突变型金葡菌肠毒素B（Mutant Staphylococcal enterotoxin B,mSEB）的亲和力。2.mAb M0313的体外中和效果评价。在小鼠脾淋巴细胞和人外周血单核细胞（PBMC）中,检测mAb M0313抑制SEB刺激细胞增殖和细胞因子释放的中和活性,采用流式细胞术,检测mAb M0313对SEB与MHCⅡ、TCR结合的阻断作用。3.mAb M0313的体内免疫保护效果评价。SEB加D-半乳糖胺对小鼠攻毒,静脉注射mAb M0313治疗,观察小鼠生存率、血清炎症因子水平和脾肺病理变化,评价抗体对SEB诱发中毒性休克的免疫保护作用;采用国际标准株MRSA252和MRSA临床分离株JN028、JN064攻毒小鼠,静脉注射mAb M0313治疗,观察小鼠生存率,评价抗体对MRSA诱发脓毒血症的免疫保护作用;小鼠腹腔注射金葡菌Xen29（携带荧光素酶报告基因）,静脉注射mAb M0313治疗,在攻毒后第1、3、5天活体成像观察细菌发光情况,评价抗体对金葡菌体内增殖的抑制作用。4.mAb M0313与SEB结合的表位定位。设计合成包含SEB全长的重叠多肽、免疫优势肽的截短肽和突变肽,采用ELISA鉴定mAb M0313与多肽的结合活性,鉴定SEB与抗体结合的B细胞表位和关键氨基酸。研究结果:1.编码抗体质粒转染HEK 293F细胞成功表达了mAb M0313,经亲和层析纯化后,纯度约为97.8%。mAb M0313与SEB和mSEB有良好结合作用并经过免疫印迹证明。BLI证实mAb M0313能以nM级的亲和力与SEB、mSEB结合。2.mAb M0313对SEB诱发小鼠脾淋巴细胞和人BPMC增殖和产生的细胞因子均具有剂量依赖的抑制作用。流式细胞术结果显示,mAb M0313能SEB与MHCⅡ结合,也能抑制SEB与TCR结合。3.在SEB诱发致死性休克小鼠模型中,mAb M0313的保护率为100%,降低了小鼠血清中的炎症因子浓度,减轻了小鼠脾脏和肺脏病理损伤情况。在MRSA诱发脓毒症中,mAb M0313对MRSA252预防性给药的保护率为100%,治疗性给药的保护率为37.5%,mAb M0313预防性给药对产SEA、C、D和E的JN028的保护率为33.3%,对产SEB的JN064的保护率为77.8%。金葡菌Xen29腹腔感染小鼠的模型中,在攻毒后第1、3、5天,活体成像显示抗体组的小鼠荧光强度都显着低于阳性对照组（P<0.05）。4.ELISA鉴定包含SEB全长的20条重叠多肽中,SEB85-102的吸光度最高。进一步鉴定SEB85-102与3条其截短多肽及6条其突变多肽,SEB85-102和SEB88-102与mAb M0313的结合为阳性;SEB85-102突变Y90或Y91或Y92后与mAb M0313的结合由阳性变为阴性阴性。研究结论:1.可获得高纯度的抗SEB mAb M0313,mAb M0313与SEB和mSEB亲和力良好,平衡解离常数可达到nM级。2.mAb M0313可在小鼠脾淋巴细胞和人PBMC中抑制SEB刺激的细胞增殖和细胞因子释放作用,并且可干扰SEB与MHCⅡ、TCR的结合作用,表明mAb M0313对SEB有良好的体外中和效果。3.mAb M0313的免疫治疗可降低体内炎症因子水平、减轻脏器病理损伤、提高生存率,从而保护感染小鼠抵抗SEB诱发的中毒性休克;同时mAb M0313也能保护MRSA攻毒小鼠所诱发的脓毒血症,减少金葡菌的体内增殖,预防性给药保护效果优于治疗性给药,对非产SEB的MRSA感染也有交叉保护作用,表明mAb M0313对SEB诱发的中毒性休克及MRSA诱发的脓毒血症具有一定的免疫保护作用。4.SEB与mAb M0313结合的B细胞表位是SEB85-102,其序列高度保守,关键氨基酸为Y90、Y91和Y92,SEB85-102与SEB90-92位于SEB三维结构的N端折叠结构域中连接五链β-桶状结构的螺旋部分。
蒋佳利[4]（2020）在《山羊源金葡菌的流行及其TSST-1诱导NLRP3炎症小体的激活》文中研究表明金黄色葡萄球菌是一种主要定植在人和动物皮肤表面、鼻咽部的革兰氏阳性胞外菌,感染后会引起人和动物的多种疾病,如脓皮症,败血症,乳房炎,关节炎等,严重威胁公共卫生安全。TSST-1是金黄色葡萄球菌的一种重要的毒力因子,属于超抗原毒素家族,在金黄色葡萄球菌致病机制中发挥着重要的作用。TSST-1具有A、B两个结构域,同其他超抗原毒素一样,可以直接通过抗原递呈细胞上的MHC II类分子,与Toll样受体分子的Vβ区结合,从而激活T细胞,引起大量炎性细胞增殖和炎性因子的产生。已有研究表明,金黄色葡萄球菌可以通过激活天然免疫模式受体中的Toll样受体和NOD样受体促进前炎细胞因子、抗炎细胞因子以及趋化因子的产生进而引发机体炎症反应,但是目前暂无关于TSST-1与宿主细胞炎症反应相关的研究。本试验在对重庆部分地区山羊鼻腔中分离到的金黄色葡萄球菌进行基因分型发现,tst1基因携带率较高。基于此我们原核表达纯化了重组TSST-1毒素,用TSST-1刺激小鼠腹腔巨噬细胞后,利用荧光定量RT-PCR,ELISA和Western Blot等技术,研究TSST-1诱导巨噬细胞炎症反应及其相关机制,试验结果如下:1.调查重庆地区山羊源性金黄色葡萄球菌流行特点及耐药情况本试验从重庆市西部和东部地区山羊养殖场中采取了167份山羊鼻拭子样本,进行了金黄色葡萄球菌的分离鉴定、超抗原毒素基因检测、基因分型和耐药性分析试验。分离鉴定出金黄色葡萄球菌45株,总检出率为26.9%（45/167）。其中大足地区的检出率最高,为29.8%（26/45）。MLVA分子分型得到27个不同的MT型,辛普森指数最高为0.8707。根据分型绘制进化树,可见同一地区的分离株具有高度相似性。超抗原毒素基因检测结果显示,sel和tst1检出率最高,为20%（9/45）,其次是sec,为17.8%（8/45）。超抗原毒素基因分型结果中可观察到8种不同的基因类型,其中以sec-sel-tst1型最多,占8.9%（4/45）。本试验中的金黄色葡萄球菌对青霉素耐药率最高,达71.11%（32/45）,其次是复方新诺明,达31.11%（14/45）。分离株中耐3种以上抗生素的有1株,多重耐药率为2.2%。2.金葡菌超抗原毒素TSST-1对巨噬细胞的致炎作用将TSST-1基因重组质粒pGEX-6P-1导入大肠杆菌模式菌株Ecoli.BL21,诱导表达并经过纯化后得到重组金葡菌超抗原毒素TSST-1。利用TSST-1刺激C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞,ELISA检测感染体系中炎症相关因子IL-1α、L-1β、TNFα和IL-6的分泌水平,结果显示,在ATP的作用下,TSST-1能够显着引起上述炎症因子的分泌。已知TSST-1毒素的135号氨基酸由组氨酸突变成丙氨酸后会失去其超抗原活性,用同样的方法得到突变的超抗原毒素,mTSST-1。利用mTSST-1刺激WT小鼠腹腔巨噬细胞,ELISA检测感染体系中炎症因子的分泌水平,结果显示,在ATP的作用下也能引起上述炎症因子的分泌,且与TSST-1无显着差异。以上结果表明,TSST-1能够在第二信号ATP的作用下对小鼠腹腔巨噬细胞产生致炎作用,且与其超抗原活性无关。3.TSST-1通过TLR4诱导巨噬细胞NLRP3炎症小体激活为研究TSST-1刺激巨噬细胞中炎症小体对IL-1β成熟与分泌的影响,利用TSST-1+ATP分别感染野生型小鼠WT和炎症小体组分缺失小鼠(Nlrp3-/-、Caspase-1-/-、Asc-/-)腹腔巨噬细胞,ELISA检测炎性相关细胞因子IL-1β和TNF-α的分泌情况,同时Western Blot检测感染后Caspase-1的活化情况。结果显示,感染后IL-1β的分泌量在3种基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞中显着下降。为探索何种细胞表面受体参与了对TSST-1的识别,我们利用TSST-1+ATP感染野生型小鼠和TLR2、TLR4组分缺失小鼠腹腔巨噬细胞,ELISA检测感染体系中炎症因子IL-1β的分泌水平变化,结果显示TLR4敲除后,IL-1β的分泌明显下降。RT-PCR检测TSST-1+ATP感染WT和Tlr4-/-小鼠巨噬细胞后IL-1β的分泌情况也显示,TLR4介导的信号通路参与了IL-1β的产生过程。以上结果共同说明TSST-1+ATP感染后,TLR4受体识别信号并引起下游炎症相关信号通路激活,诱导NLRP3炎症小体活化,从而使Caspase-1激活并切割pro-IL-1β,使之成熟并分泌。
张力文[5]（2020）在《11种毒素AlphaLISA检测体系的建立》文中研究表明生物毒素由其来源大致可分为真菌毒素、细菌毒素、植物毒素、动物毒素及海洋生物毒素等。本研究选取11种生物毒素进行研究,其中包括细菌毒素金黄色葡萄球菌5种主要肠毒素（SEA、SEB、SEC、SED、SEE）,A型肉毒毒素（Bo NT-A）,产气荚膜梭菌α毒素（CPA）和产气荚膜梭菌ε毒素（ETX）;两种植物毒素相思子毒素（AT）和蓖麻毒素（RT）,一种小分子真菌毒素T-2毒素。这11种毒素均可以引起人类中毒事件的发生。中毒事件一旦发生,最重要的就是快速检测出中毒毒素的种类和大致剂量。为提高这11种毒素的检测效率,本研究建立了这11种毒素的Alpha LISA检测体系。研究分为两个部分,第一部分建立了针对10种毒素（SEA、SEB、SEC、SED、SEE、Bo NT-A、CPA、ETX、AT、RT）的双抗体夹心Alpha LISA检测体系。研究的第二部分针对小分子T-2毒素建立了竞争法Alpha LISA检测体系。Alpha LISA技术是一种快速检测方法,这种方法所需样本量小,操作简便,用时较少,准确度高。在建立这11种毒素的Alpha LISA检测体系中,我们首先利用ELISA技术筛选出每种毒素的最适配对抗体,用筛选出的最适抗体进行Alpha LISA预实验,优化反应条件,确定每种毒素的最适检测方案。然后,使用11种纯化毒素进行Alpha LISA检测,绘制毒素的标准曲线,评价每种毒素的检出限、特异性、重复性等指标。随后,设计制备SEA模拟样本,Bo NT-A模拟样本,T-2毒素模拟样本评价Alpha LISA检测体系的灵敏度。我们还搜集了肉毒毒素临床样本对肉毒毒素Alpha LISA检测体系进行评价,比较试验结果与临床症状的相关性。研究结果显示,在我们所建立的11种毒素Alpha LISA检测体系的灵敏度均在1ng/m L以下,其中SEB的灵敏度达到25pg/m L。特异性良好,建立完成的11种毒素Alpha LISA检测体系均未与其它毒素发生交叉反应。重复性较好,批间和批内变异系数均在10%以下。本研究第一部分中在以SEA模拟样本评价Alpha LISA检测体系时,该方法表现出对食品基质的良好的抗干扰能力:在SEA全脂牛乳模拟样本中,Alpha LISA检测方法的最低检出限（LOD）为0.1ng/m L。在10%（w/v）浓度的SEA乳制品模拟样本中,Alpha LISA检测方法的LOD为0.1ng/m L;在20%（w/v）浓度的SEA乳制品模拟样本中,LOD只能达到1ng/m L。在10%（w/v）和20%（w/v）两种浓度的SEA豆制品和腌制肉类模拟样本中,Alpha LISA检测方法的LOD均可以达到0.1ng/m L。除20%（w/v）浓度的SEA花生酱模拟样本的LOD为0.2ng/m L以外,花生酱、豆瓣酱和火腿肠这三种食品模拟样本在不同稀释质量分数下的LOD均为0.1ng/m L。采用A型肉毒毒素血浆模拟样本评价Alpha LISA检测体系时,由于血浆中部分成份的影响,血浆原液中Bo NT-A的LOD只能到0.4ng/m L,但缓冲液等比稀释的血浆中,Alpha LISA检测Bo NT-A的LOD为0.1ng/m L。A型肉毒毒素蒸馏水模拟样本中,Alpha LISA检测Bo NT-A的LOD可以达到0.1ng/m L。本研究第二部分中以T-2毒素模拟样本评价Alpha LISA检测体系时,在2%（w/v）、5%（w/v）和10%（w/v）浓度的T-2毒素玉米粉模拟样本中,Alpha LISA检测方法的LOD均可以达到0.05ng/m L,与缓冲液中LOD一致。以T-2毒素商业化模拟样本评价Alpha LISA检测体系时,2%（w/v）浓度T-2毒素模拟样本的回收率为89.49%～96.29%,商业化ELISA试剂盒的回收率为80.25%～121.29%,Alpha LISA检测方法的回收率明显优于ELISA。当T-2毒素模拟样本的浓度稀释至1%（w/v）时,Alpha LISA检测方法的回收率为87.16%～92.50%,商业化ELISA试剂盒的回收率为37.52%～95.16%,可见在低浓度的模拟样本中,Alpha LISA方法依然可以获得较好的回收率。本研究建立了可以引起人类中毒的11种毒素的Alpha LISA检测体系,与常用的ELISA方法相比,该方法可以提供快速、高特异性和高灵敏度的检测,可为此11种毒素中毒的检测提供参考。
高婷婷[6]（2019）在《转录调节因子XtgS影响无乳链球菌毒力的机制研究及鱼源无乳链球菌超抗原的筛选》文中指出无乳链球菌（Streptococcusagalactiae）是一种重要的人畜共患病原菌,感染谱广泛,如新生儿、未孕女性、老年人、奶牛、暖水鱼类等,定殖能力强,可适应宿主体内不同部位。近年来,罗非鱼无乳链球菌病的爆发给养渔业造成严重危害,导致巨大的经济损失,因此,研究鱼源无乳链球菌的致病机制成为热点问题。鱼源无乳链球菌GD201008-001特有序列中含有一个与毒力相关的DNA结合蛋白XtgS,阐明 XtgS调控无乳链球菌的毒力机制,进一步了解无乳链球菌的致病机理,为该病原的防控提供理论依据。1 XtgS互补株的构建及XtgS对毒力的影响前期研究发现,缺失株ΔxtgS的毒力上升,但质粒互补株CΔxtgS pSET2-xtgS无法恢复XtgS的功能。本试验构建了质粒互补株CΔxtgSpSET2-SPC-xtgS、基因组原位互补株CΔxtgSxtgS和两个异位互补株 C ΔxtgS1-PxtgST 与 CΔxtgS2-PxtgST。通过 Real-time PCR 对 xtgS及其上下游基因的转录水平进行分析,发现CΔxtgSxtgS与CΔxtgS2-PxtgST（命名为CΔxtgS）可完全恢复xtgS及其上下游基因的正常转录水平,且缺失株ΔxtgS上游基因A9641958的转录水平显着上升。GD201008-001、ΔxtgS与CΔxtgS对斑马鱼的半数致死量（LD50）结果显示,缺失株ΔxtgS的毒力明显上升（p<0.05）,与前期结果相同,互补株CΔxtgS恢复了部分毒力;生存曲线显示感染互补株的斑马鱼存活率上升。上述结果说明,互补株CΔxtgS恢复了 XtgS的功能,并推测XtgS通过调控其上游基因A9641958的表达来影响鱼源无乳链球菌毒力。2 XtgS过表达菌株（A909xtgS）的转录组分析及毒力变化为了进一步明确XtgS的功能,以无xtgS基因的人源株A909为研究对象,获得过表达菌株A909xtgS与空质粒对照菌株A909pSET2。转录组测序分析与Real-time PCR结果显示,A909xtgS中SAK1102～1105（转铁系统1）与SAK1425～1428（转铁系统2）的转录水平下调,SAK1829～1835（PTS系统）的转录水平上调。A909、A909xtgS与A909 pSET2的生物学性状比较显示,生长速度无差异,A909xtgS对斑马鱼的毒力明显下降（p<0.05）,A909pSET2与A909毒力较为接近;生存曲线显示感染了 A909xtgS的斑马鱼存活率明显上升。在GD201008-001、ΔxtgS与CΔxtgS中进行差异基因转录水平的验证,发现ΔxtgS缺失株中转铁系统1与2的转录表达上调,与A909xtgs中产生的下调作用相对应。同时对GD201008-001中特异性10kb序列进行转录水平的研究,发现ΔxtgS中A9641958与A9641957的转录水平上调数十倍,与第三章中Real-time PCR结果一致,其余基因无明显变化。上述结果表明,XtgS是转录调节抑制子,主要通过阻遏转铁系统1、2及A9641958与A9641957的转录,影响不同无乳链球菌的毒力。3 XtgS蛋白的重组表达及其转录结合位点的确定为了确定XtgS蛋白的转录结合位点,本试验首先通过原核表达与纯化,获得可溶性单倍体蛋白rXtgS1-75aa与二聚体蛋白rXtgSdimer,分别与可能调控的三个操纵子的启动子序列（250bp左右）共孵育,进行凝胶阻滞试验（EMSA）。结果显示,单倍体蛋白rXtgS1-75aa没有结合DNA的功能,二聚体蛋白rXtgSdimer直接结合于A964 1958启动子区域,不结合于转铁系统1,2的启动子区域。将不同长度的启动子序列融入pTCV-lac质粒后分别转入GD201008-001、ΔxtgS及CΔxtgS中,进行β-半乳糖苷酶活性试验。结果显示,XtgS结合的靶序列位于A9641958启动子的P149～191bp。综上,XtgS蛋白通过直接结合A9641958启动子的关键部位（P149～191）来抑制该基因的转录表达,与Real-time PCR数据相结合,XtgS蛋白对转铁系统1,2的转录调节是间接性的。4无乳链球菌GD201008-001中超抗原的筛选罗非鱼源无乳链球菌GD201008-001对小鼠的致死率极高,极低数量的细菌（10 CFU/只）攻毒12 h后小鼠即表现出临床症状,24 h内全部死亡。这一现象与人类感染链球菌后产生的中毒性休克综合征（STSS）症状相似,STSS是由链球菌超抗原引起,故推测GD201008-001在感染小鼠的过程中可能会分泌某种超抗原。为了检测GD201008-001是否分泌超抗原,首先通过对该菌基因组进行超抗原的生物信息学分析,并用该菌在体外培养基环境下的上清与感染小鼠后分离的血清,分别刺激淋巴细胞,再用MTS 比色法来测定淋巴细胞的增殖结果,来判定是否有超抗原的存在。结果表明,在GD201008-001基因组中不含已知的超抗原或超抗原样蛋白基因,GD201008-001在体外培养基环境下和体内小鼠感染过程中,均未释放可使淋巴细胞明显增殖的超抗原物质,该强毒株对小鼠高致死率的致病机理仍需进一步的探索。
张道锋[7]（2018）在《银白色葡萄球菌毒力基因预测和两个新型超抗原鉴定》文中进行了进一步梳理银白色葡萄球菌（Staphylococcus argenteus）和施韦策葡萄球菌（S.schweitzeri）是2015年鉴定的金黄色葡萄球菌（S.aureus）近缘新种,在此之前它们被认为是金黄色葡萄球菌的两个远源支系。这三个物种组成新的金黄色葡萄球菌复合群（S.aureus complex,SAC）。绝大多数银白色葡萄球菌分离自人体,可引起与金黄色葡萄球菌类似的感染。施韦策葡萄球菌主要分离自大猩猩和蝙蝠,虽然有人源分离株出现,但尚未发现可以感染人类。这三个物种表型特征非常相似,基因组水平的差异也比一般物种间的遗传距离要近。银白色葡萄球菌与人类健康相关,本论文针对银白色葡萄球菌开展了以下方面的研究。1、在中国华东地区鉴定出银白色葡萄球菌。为了揭示中国是否有银白色葡萄球菌出现,本论文通过菌落颜色观察,从中国华东地区的839株“金黄色葡萄球菌”中筛选到89株（10.6%）白色菌株。为了区分鉴定这些“白色菌株”是银白色葡萄球菌还是金黄色葡萄球菌,首先通过泛基因组分析得到SAC的核心基因,然后筛选核心基因得到了一个在SAC物种间有一段180 bp插入缺失突变的非核糖体多肽合成酶基因（nonribosomal peptide synthetase,NRPS）。使用针对NRPS基因插入缺失区段的引物对这89株菌进行PCR扩增,结果分为三组:6株菌（6.8%）条带大小符合银白色葡萄球菌特征;75株（84.3%）符合金黄色葡萄球菌特征;另外8株没有条带。利用16S r RNA、rpo B基因鉴定和多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）进行进一步分析,上述的三组菌株分别被鉴定为银白色葡萄球菌（6株）,金黄色葡萄球菌（75株）和其他细菌（8株）。这表明,基于菌落表型观察和NRPS基因PCR片段大小的“两步法”可快速区分并鉴定金黄色葡萄球菌和银白色葡萄球菌,并且在中国华东地区鉴定出6株银白色葡萄球菌。2、系统的基因组分析揭示银白色葡萄球菌含有大量毒力基因并在国际间传播。从本研究获得的6株银白色葡萄球菌中挑选5株进行基因组测序,并下载公共数据库中SAC代表菌株的基因组数据,共收集51个SAC菌株的基因组数据进行系统的比较基因组学分析。结果表明,SAC物种间在核心基因组上存在普遍分化,种间同源重组比率很低,一些SCCmec元件（staphylococcal cassette chromosome mec elements）和原噬菌体的亚型同时出现在不同的物种中。针对金黄色葡萄球菌的111个毒力基因在银白色葡萄球菌中进行分析,发现有85个（76.6%）毒力基因在银白色葡萄球菌中存在同源基因。银白色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌在毒力基因目录（基因有无）上没有明显差异,但是核心毒力基因在序列上有明显分化。加上已有银白色葡萄球菌导致人类感染的报道,这表明了该物种具有和金黄色葡萄球菌类似的致病性潜力。对银白色葡萄球菌ST（sequence type）2250开展进化分析,发现不同来源菌株没有按照地域聚集成簇,这表明ST2250已经在国际间发生传播。3、银白色葡萄球菌ST2250含有谱系特异的两个新型超抗原。毒力基因分析发现,有两个基因被划分在已知的肠毒素超抗原基因家族里,但和已知的肠毒素超抗原基因氨基酸序列同源性均小于65.3%。进一步分析发现,这两个基因出现在SAC三个物种部分谱系中v Saβ基因岛的上游,尤其是所有的银白色葡萄球菌ST2250菌株均含有这两个基因。这两个基因编码的蛋白质分别被命名为SEl26和SEl27。编码SEl26和SEl27的m RNA在金黄色葡萄球菌的稳定期早期出现最高表达量,在银白色葡萄球菌和施韦策葡萄球菌的指数生长期出现最高表达量。SEl26和SEl27的重组蛋白对小鼠脾细胞和人源外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）均具有刺激细胞增殖和产生细胞因子活性。这表明,SEl26和SEl27具有和已知的葡萄球菌肠毒素超抗原类似的生物活性。因为它们的氨基酸序列与已知肠毒素超抗原的同源性低于定义不同超抗原的阈值10%,所以将SEl26和SEl27认定为两种新型的葡萄球菌肠毒素超抗原。上述研究结果表明,银白色葡萄球菌已经在我国华东地区出现,在基因组水平具有明显的致病性潜力,并且可以产生新型肠毒素超抗原。基于菌落表型观察和NRPS基因PCR片段大小的“两步法”是筛查银白色葡萄球菌的有效方法,将加速世界范围内银白色葡萄球菌的流行病学调查,而SEl26和SEl27的发现丰富了SAC的毒力基因库。
刘昭鑫[8]（2018）在《超抗原SEN和SEQ的初步晶体学研究》文中指出超抗原（Superantigens,SAgs）是一类特殊的抗原分子,能够引起T细胞非特异性激活,产生极强的免疫应答效应,引发如中毒性休克综合征、多器官衰竭和自身免疫性疾病等严重的临床症状。另一方面,超抗原又能刺激机体产生大量有生物活性的细胞因子,增强机体对肿瘤的杀伤活性。金黄色葡萄球菌肠毒素N（Staphylococcus entertoxin N,SEN）和金黄色葡萄球菌肠毒素Q（Staphylococcus entertoxin Q,SEQ）是近年分离出的新型超抗原,在众多食物性中毒事件中扮演着重要角色。目前为止,SEN和SEQ引发免疫效应的作用机制尚不明确。本研究通过基因扩增方法获得sen和seq基因,分别将sen和seq基因克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建得到重组表达质粒pGEX-6P-1-sen和pGEX-6P-1-seq,将重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中,分别获得SEN和SEQ蛋白表达菌株。将SEN和SEQ蛋白在大肠杆菌中高效可溶表达,破碎菌体获得可溶蛋白,通过GST亲和层析、Mono Q离子交换层析、Superdex 200分子排阻层析等一系列层析方法获得高纯度SEN和SEQ蛋白。使用结晶试剂盒,采用坐滴结晶法对SEN和SEQ蛋白进行结晶条件筛选与优化,最终在2%（v/v）TacsimateTMM pH 4.0,0.1 M三水合乙酸钠pH 4.5,12%（w/v）聚乙二醇3350和6%（v/v）乙二醇,0.1 M柠檬酸pH 3.5,8%（w/v）聚乙二醇6000分别获得SEN和SEQ蛋白的高质量晶体,并通过SDS-PAGE和Western blot验证晶体为蛋白质晶体。获得的SEN和SEQ晶体进行X射线衍射,得到SEN（2.0?分辨率）和SEQ（3.0?分辨率）衍射数据。通过HKL-2000、iMosflm、CCP4、COOT、Phenix等软件处理衍射数据,解析获得了SEN和SEQ蛋白结构。本研究为SEN和SEQ的精细结构分析及SEN/SEQ-MHC-TCR三元复合物结构的解析奠定了基础,有助于从结构角度阐明SEN和SEQ的作用机制,从而为药物设计和疾病预防提供理论支持。
侯天全[9]（2016）在《超抗原SEB疫苗rS-H的研制及其免疫效果研究》文中研究指明金黄色葡萄球菌是引起人类食物中毒、软组织与骨组织感染以及致命性中毒性休克中的罪魁祸首,这种常见的细菌可以合成包括金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）在内的多种多样的毒力因子,该超抗原在皮摩尔浓度水平下就能够直接与抗原递呈细胞上的II类主要组织相容性复合体分子（MHC II）以及T细胞受体（TCR）Vβ区域上的特异性结构域直接相连接,快速并过量激活感染者的免疫系统引起各种炎症因子以及趋化因子的大量释放并且最终导致高烧、急性肺损伤、急性呼吸困难、多器官衰竭以及致死性休克等威胁生命安全的症状。针对超抗原的治疗得到了世界范围内的关注,多种基于抗体、疫苗以及其它小分子的治疗研究已经展开。本研究采用分子克隆的方法将修改过TCR Vβ结合区的SEB基因（rSEB）与结核分枝杆菌热休克蛋白65（HSP65）基因融合,构建原核表达质粒pET-28a-rS-H,经表达成功获得一种新型的SEB重组疫苗rS-H。在对表达及纯化工艺进行优化后得出:通过对诱导表达条件的优化,将目的蛋白的表达量提高了约15%;通过对包涵体洗涤条件、包涵体裂解条件以及包涵体复性条件的优化将粗纯品中目的蛋白的纯度提高约40%;通过对金属螯合层析的上样流速以及Q阴离子交换层析的梯度洗脱长度进行优化,重组蛋白的纯度可以提高到90%以上,最终收率可以提高到45%以上。在对该疫苗的免疫效果进行考察中发现:经过3次皮下免疫小鼠后,通过对抗SEB特异性抗体效价结果、攻毒保护实验保护率及抗体体外中和试验结果的分析,重组蛋白rS-H成功诱导了体液免疫应答,抗SEB特异性抗体效价最高值接近215,显着高于其他疫苗对照组（P<0.01）;r S-H疫苗在5×LD50毒素剂量以及2×LD50毒素剂量攻毒后保护率分别达到80%（i.n.）与90%（i.p.）,高于其它疫苗对照组;并且有效缓解攻毒后引起的肺部、心脏以及肾脏组织的出血情况与病变情况;在LD50与LD10剂量下分别经腹腔与滴鼻攻毒后,rS-H疫苗组可以抑制各细胞因子的升高,显着低于阴性对照组（P<0.01）;体外攻毒实验中,rS-H疫苗组诱导的特异性抗体可以有效中和SEB毒素并且抑制SEB引起的各炎症细胞因子升高,各细胞因子水平显着低于对照组（P<0.05）。以上结果表明,本研究制备的rS-H可以有效引起体液免疫应答,成功诱导抗SEB抗体,并且在攻毒后可以有效缓解SEB引起的症状。
王华菁[10]（2013）在《高效抗SEB中和保护性抗体的作用及其机制研究》文中研究指明葡萄球菌肠毒素（Staphyloccucal enterotoxins,SEs）是由葡萄球菌分泌的细菌外毒素，目前已报道的有SEA、SEB、SEC1-3、SED、SEE、SEF、SEG等二十多种血清型，共称为葡萄球菌SE类超抗原，是细菌性食物中毒、化脓性感染、院内感染的重要毒素。作为一类超抗原，通过桥联结合抗原提呈细胞上的MHC II类分子和TCR的β链V区，形成MHC II类分子:SEs:TCR的三元复合物，直接激活T淋巴细胞，并导致一系列炎症细胞因子的释放，从而引起高热、恶心、腹泻及毒素休克综合征（TSS）。由金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）引起的TSS的病死率可达50%，与流感并发的SEB感染的死亡率更高达90%以上，因此SEB被美国特殊作战处列为常规储存的"标准"（"经典"）生物战剂。目前临床上尚无针对SEB中毒的有效疫苗和药物，而治疗性单克隆抗体因其具有高特异性和低毒副作用的特性，常在SEB的防治过程中被列为首选方案。国内外的多个研究小组也获得了一些鼠源抗SEB的中和性单克隆抗体，但只能达到部分的中和保护效果（63%），其对SEB诱导的T淋巴细胞激活的抑制作用也仅为50-75%；说明单一的单克隆抗体并非是超抗原家族致病过程最理想的抑制剂。而多种中和性抗体的联合应用，虽可实现理想的协同作用，但由于其成分相对复杂、在药效学评价方面需多次进行临床实验等因素，限制了推广和应用。此外，由于多数中和性抗体的结合表位不明确，抗体的中和保护机制尚不明了，使研究难以有突破性进展，因此筛选中和保护性抗体、确定其结合表位，明确其中和保护的作用机制对于研制SEB的治疗性抗体具有十分重要的意义。本项研究旨在利用本实验室已获得的具有中和保护作用抗SEB的单克隆抗体的前提下，进一步通过鼠源3E2与SEB的共结晶，解析了SEB与中和保护抗体的作用界面，明确了SEB与鼠源3E2抗体结合表位的关键位点，初步阐明其中和保护作用的机制；进一步采用基因工程方法构建高效的双可变区（DVD）可同时中和SEB MHC和TCR结合位点的中和性抗体3E2-4A3，研究主要包括三个部分：一、抗SEB中和保护性抗体的作用及其结构基础在前期的研究中，我们通过大肠杆菌原核表达系统融合表达了GST-SEB蛋白，免疫Balb/C小鼠后，采用杂交瘤技术制备了10株具有中和保护作用的鼠源性单克隆抗体，并采用噬菌体12肽库表位淘选了其中具有较高结合力的四株抗体，初步确定了m4A3、m3C1结合于SEB的TCR功能域，m3E2抗体结合于SEB的MHC II类分子功能域，m1A5结合于MHC II类分子功能域的附近。m3E2抗体的亲和力略高于其它三株。为了进一步确定m3E2抗体的中和保护作用的中和表位，我们将m3E2抗体与SEB做了共结晶，通过解析发现m3E2抗体主要结合于SEB MHC II类分子的结合功能域44FLYF47和71KDLADK76。我们将这几处位置的氨基酸做了定点突变并在大肠杆菌原核表达系统中表达了突变体蛋白，通过ELISA、Western blot、3H增殖实验及体外抑制细胞因子释放实验，证实SEB46Y和71K为m3E2与其结合的关键氨基酸。进一步我们分别将46Y突变成E/F/L/M，将71K突变成N/Q/R，通过Biacore测定其亲和力，结果发现当46Y突变成E（谷氨酸）、Q（谷氨酰胺）时，SEB与m3E2不结合；当突变成F（苯丙氨酸）、M（甲硫氨酸）和R（精氨酸）时，亲和力基本无变化，提示局部维持疏水环境对维护m3E2与SEB的紧密结合具有重要作用；而当71K突变成L（亮氨酸）、N（天冬氨酸）时，亲和力分别由原来的5.7E-10下降至3.14E-8和1.41E-6。46Y的突变结果提示局部维持疏水环境对维护m3E2与SEB的紧密结合具有重要作用，71K的突变结果说明局部正电荷环境对抗原抗体间的亲和力变化具有重要的意义。二、抗SEB中和保护性抗体的协同作用为了探讨鼠源抗SEB中和保护性抗体的协同作用，我们将m3E2与其他三株中和保护性抗体进行了组合分组，通过3H增殖实验和体外抑制细胞因子释放实验发现，m3E2+m4A3联合应用对T细胞增殖的抑制作用达到73%，m3E2+m3C1的抑制效率为68%，而单用这三株抗体的抑制率平均在60%左右；m3E2+m4A3联合应用对细胞因子IL-2、INF-γ、TNF-α释放的抑制作用分别达到67.4%、68.8%和69%，m3E2+m3C1组的抑制效率为59.7%、64%、61.4%，而它们单用的抑制率平均仅有40%左右，表明m3E2+m4A3和m3E2+m3C1这两组针对SEB不同功能域的抗体联合应用具有协同作用，且m3E2+m4A3联合应用的效果明显优于m3E2+m3C1。而其它几组针对SEB相同功能域的抗体联合应用后，T细胞增殖的抑制率在50%左右，对细胞因子释放的抑制作用仅在32%左右，说明联合应用不同功能域的抗体，对SEB的中和保护作用具有协同作用，而相同功能域的协同作用不显着。三、高效抗SEB双可变区抗体的构建及功能鉴定采用基因工程技术，构建了两种结构的DVD抗体3E2-4A3和4A3-3E2，共转染CHO细胞，瞬转结果显示，DVD3E2-4A3的结合活性要优于DVD4A3-3E2。体内外实验证明，DVD3E2-4A3抗体的体内外中和活性均强于单个亲源抗体。同时发现DVD抗体较单个亲源抗体具有更高的亲和力（10倍），说明其高效的优势不仅是通过对MHCII和TCR功能域的双阻断，而且由于其更高的亲和力，实现了对SEB的高效的中和保护作用。本研究在前期获得了10株SEB特异性单克隆抗体的基础上，通过m3E2和SEB蛋白的共结晶，解析了SEB与抗体的作用界面，通过定点突变证实SEB46Y和71K为m3E2与其结合的关键氨基酸，探讨了抗SEB抗体中和保护作用的结构基础；进一步比较了几株中和保护性抗体的协同作用，发现针对不同功能域的抗体之间具有协同作用，而同一功能域的中和保护性抗体的协同作用不显着；在此基础上，构建获得了可同时结合SEB TCR和MHCII不同功能域的高效双可变区抗体DVD3E2-4A3，并证实其中和保护作用优于双抗体的联合使用。针对双功能表位的双可变区抗体可能成为抗SEB的新的治疗策略，为研制抗SEB新型抗体类药物作出了探索。
二、超抗原SED突变体的构建表达和鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、超抗原SED突变体的构建表达和鉴定（论文提纲范文）
（2）超抗原与人TCR-CD3复合物的相互作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题研究的背景和意义 |
| 1.2 TCR-CD3复合物简介 |
| 1.2.1 TCR-CD3复合物 |
| 1.2.2 TCR-CD3复合物的结构 |
| 1.2.3 TCR-CD3复合物的功能 |
| 1.3 超抗原简介 |
| 1.3.1 超抗原 |
| 1.3.2 超抗原结构 |
| 1.3.3 超抗原结合Ⅱ类MHC和 TCR |
| 1.3.4 超抗原功能 |
| 1.3.5 超抗原产生的演变 |
| 1.3.6 超抗原的内源性凹陷 |
| 1.4 交联剂 |
| 1.5 国内外在该方向的研究现状及分析 |
| 1.5.1 国外研究现状 |
| 1.5.2 国内研究现状 |
| 1.5.3 国内外研究的简析 |
| 1.6 主要研究内容 |
| 1.7 实验技术路线 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 载体、细胞与菌株 |
| 2.1.2 克隆所需试剂 |
| 2.1.3 蛋白表达纯化相关试剂 |
| 2.1.4 其它相关试剂 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.2 实验原理及方法 |
| 2.2.1 分子克隆 |
| 2.2.2 蛋白表达与纯化 |
| 2.2.3 蛋白免疫印迹(Western Blot) |
| 2.2.4 相互作用检测 |
| 2.2.5 负染制样 |
| 第3章 蛋白的表达与纯化 |
| 3.1 超抗原的表达与纯化 |
| 3.1.1 表达载体的构建 |
| 3.1.2 超抗原的表达检测 |
| 3.1.3 超抗原的纯化 |
| 3.2 TCR/CD3复合物的表达与纯化 |
| 3.2.1 表达载体的构建 |
| 3.2.2 TCR/CD3复合物的表达与纯化 |
| 3.3 pMHC的表达与纯化 |
| 3.3.1 表达载体的构建 |
| 3.3.2 pMHC的表达与纯化 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 超抗原与TCR/CD3 复合物及pMHC的相互作用研究 |
| 4.1 SEA与2IAL TCR/CD3 的相互作用 |
| 4.2 SEH与2IAL TCR/CD3 的相互作用 |
| 4.3 SEA与2IAL TCR/CD3及p MHC的相互作用 |
| 4.4 SEH与2IAL TCR/CD3及p MHC的相互作用 |
| 4.5 SEH与6CQL TCR/CD3及p MHC的相互作用 |
| 4.6 交联剂对超抗原与TCR/CD3 复合物及p MHC相互作用的影响 |
| 4.7 Zn~(2+)浓度对SEH与 TCR/CD3 复合物及p MHC相互作用的影响 |
| 4.8 TCR/CD3-SEH-pMHC复合物透射电子显微镜观察结果 |
| 4.9 本章小结 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）金黄色葡萄球菌肠毒素B人源性单克隆抗体的生物学特性研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 选题依据 |
| 1.2 研究背景 |
| 第二章 单克隆抗体M0313的表达纯化及亲和力鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 单克隆抗体M0313的体外中和效果评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 单克隆抗体M0313的体内免疫保护效果评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 单克隆抗体M0313与金黄色葡萄球菌肠毒素B结合的表位鉴定 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 葡萄球菌肠毒素B的中和策略 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的成果 |
| 致谢 |
（4）山羊源金葡菌的流行及其TSST-1诱导NLRP3炎症小体的激活（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 金黄色葡萄球菌概述 |
| 1.1.1 金黄色葡萄球菌流行现状 |
| 1.1.2 金黄色葡萄球的主要毒力因子 |
| 1.2 金黄色葡萄球菌超抗原毒素研究进展 |
| 1.2.1 金葡菌超抗原毒素的分类 |
| 1.2.2 金葡菌超抗原毒素结构和生物学特性 |
| 1.2.3 金葡菌超抗原毒素TSST-1研究进展 |
| 1.3 金黄色葡萄球菌与炎症小体 |
| 1.3.1 炎症小体概述 |
| 1.3.2 NLPR3炎症小体激活机制 |
| 1.3.3 炎症小体在宿主抗金黄色葡萄球菌感染中的作用 |
| 1.3.4 金黄色葡萄球菌相关毒素与炎症小体相互作用机制 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究目的与意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.2.1 调查重庆地区山羊源性金黄色葡萄球菌流行特点及耐药情况 |
| 2.2.2 金葡菌超抗原毒素TSST-1对巨噬细胞的致炎作用 |
| 2.2.3 TSST-1 通过TLR4 诱导巨噬细胞NLRP3 炎症小体激活 |
| 第3章 重庆地区山羊源性金黄色葡萄球菌流行特点及耐药情况 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 样本来源及标准菌株 |
| 3.1.2 主要培养基及试剂 |
| 3.1.3 主要培养基配制 |
| 3.1.4 药敏纸片 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 细菌分离及鉴定 |
| 3.2.2 数据分析 |
| 3.2.3 分离株药物敏感性试验 |
| 3.2.4 超抗原毒素基因检测试验 |
| 3.2.5 分离株MLVA分型试验 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 山羊源性金黄色葡萄球菌分离情况 |
| 3.3.2 分离株药物敏感性试验结果 |
| 3.3.3 分离株超抗原毒素基因检测结果 |
| 3.3.4 MLVA分型结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 金葡菌超抗原毒素TSST-1对巨噬细胞的致炎作用 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 主要试剂与材料 |
| 4.1.2 主要试剂配制 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 重组质粒的转化 |
| 4.2.2 金黄色葡萄球菌超抗原毒素TSST-1的原核表达及纯化 |
| 4.2.3 巨噬细胞提取与培养 |
| 4.2.4 超抗原毒素TSST-1刺激细胞试验 |
| 4.2.5 ELISA检测细胞因子分泌水平 |
| 4.2.6 数据处理与分析 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 金葡菌超抗原毒素TSST-1的原核表达及纯化 |
| 4.3.2 金葡菌超抗原毒素TSST-1刺激巨噬细胞产生炎症反应 |
| 4.3.3 m TSST-1与TSST-1 引起巨噬细胞炎症因子分泌无差异 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 TSST-1 通过TLR4 诱导巨噬细胞NLRP3 炎症小体激活 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 主要试剂与材料 |
| 5.1.2 主要试剂配制 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 Real-time fluorescent quantitative PCR |
| 5.2.2 Western blot检测蛋白水平 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 TSST-1 诱导细胞炎症反应和NLRP3炎症小体的关系 |
| 5.3.2 TSST-1 刺激细胞通过TLR4 激活NLRP3炎症小体 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表文章与及参加会议 |
（5）11种毒素AlphaLISA检测体系的建立（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 金黄色葡萄球菌肠毒素 |
| 1.2 相思子、蓖麻毒素 |
| 1.3 产气荚膜梭菌α、ε毒素 |
| 1.4 A型肉毒毒素 |
| 1.5 T-2毒素 |
| 1.6 毒素的检测技术 |
| 1.7 AlphaLISA检测技术 |
| 1.8 本研究的目的和意义 |
| 第一部分 双抗体夹心AlphaLISA检测体系的建立 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 抗原和抗体来源 |
| 1.2 主要实验试剂和实验材料 |
| 1.2.1 ELISA实验缓冲试剂 |
| 1.2.2 AlphaISA实验缓冲试剂 |
| 1.2.2.1 抗体偶联受体微球缓冲试剂 |
| 1.2.2.2 AlphaLISA实验用缓冲液 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 筛选最适抗体对 |
| 2.1.1 生物素标记抗体 |
| 2.1.2 酶联免疫吸附试验 |
| 2.2 AlphaLISA预实验 |
| 2.2.1 受体微球偶联抗体 |
| 2.2.2 AlphaLISA反应体系及条件优化 |
| 2.3 AlphaLISA检测体系的建立 |
| 2.3.1 使用纯化毒素蛋白对AlphaLISA检测方法的评价 |
| 2.3.2 使用模拟样本对AlphaLISA检测方法的评价 |
| 2.3.2.1 SEA食品模拟样本 |
| 2.3.2.2 A型肉毒毒素食品模拟样本 |
| 2.3.2.3 A型肉毒毒素临床模拟样本 |
| 2.3.2.4 A型肉毒毒素饮用水模拟样本 |
| 2.3.3 使用临床样本对AlphaLISA检测方法的评价 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 10种毒素AlphaLISA检测最优抗体对筛选结果 |
| 3.2 使用纯化毒素蛋白对AlphaLISA检测方法的评价结果 |
| 3.2.1 AlphaLISA检测金黄色葡萄球菌A~E型肠毒素的标准曲线 |
| 3.2.1.1 AlphaLISA检测金黄色葡萄球菌A型肠毒素标准曲线的建立 |
| 3.2.1.2 AlphaLISA检测金黄色葡萄球菌B型肠毒素标准曲线的建立 |
| 3.2.1.3 AlphaLISA检测金黄色葡萄球菌C型肠毒素标准曲线的建立 |
| 3.2.1.4 AlphaLISA检测金黄色葡萄球菌D型肠毒素标准曲线的建立 |
| 3.2.1.5 AlphaLISA检测金黄色葡萄球菌E型肠毒素标准曲线的建立 |
| 3.2.2 AlphaLISA检测金黄色葡萄球菌A~E型肠毒素的重复性 |
| 3.2.3 AlphaLISA检测金黄色葡萄球菌A~E型肠毒素的特异性 |
| 3.2.3.1 金黄色葡萄球菌A型肠毒素AlphaLISA检测体系的特异性 |
| 3.2.3.2 金黄色葡萄球菌B型肠毒素AlphaLISA检测体系的特异性 |
| 3.2.3.3 金黄色葡萄球菌C型肠毒素AlphaLISA检测体系的特异性 |
| 3.2.3.4 金黄色葡萄球菌D型肠毒素AlphaLISA检测体系的特异性 |
| 3.2.3.5 金黄色葡萄球菌E型肠毒素AlphaLISA检测体系的特异性 |
| 3.2.4 相思子、蓖麻毒素对AlphaLISA检测方法的评价结果 |
| 3.2.4.1 AlphaLISA检测相思子、蓖麻毒素标准曲线的建立 |
| 3.2.4.2 AlphaLISA检测相思子、蓖麻毒素的重复性 |
| 3.2.4.3 AlphaLISA检测相思子、蓖麻毒素的特异性 |
| 3.2.5 产气荚膜梭菌α、ε毒素,A型肉毒毒素对AlphaLISA检测方法的评价结果 |
| 3.2.5.1 AlphaLISA检测产气荚膜梭菌α、ε毒素,A型肉毒毒素标准曲线的建立 |
| 3.2.5.2 AlphaLISA检测产气荚膜梭菌α、ε毒素,A型肉毒毒的重复性 |
| 3.2.5.3 AlphaLISA检测产气荚膜梭菌α、ε毒素,A型肉毒毒的特异性 |
| 3.3 使用模拟样本对AlphaLISA检测方法的评价 |
| 3.3.1 SEA模拟样本对AlphaLISA检测方法的评价结果 |
| 3.3.2 A型肉毒毒素食品模拟样本对AlphaLISA检测方法的评价结果 |
| 3.3.3 A型肉毒毒素临床模拟样本对AlphaLISA检测方法的评价结果 |
| 3.3.4 A型肉毒毒素饮用水模拟样本对AlphaLISA检测方法的评价结果 |
| 3.3.5 A型肉毒毒素呕吐物样本对AlphaLISA检测方法的评价结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 T-2毒素AlphaLISA检测体系的建立及评价 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 抗原和抗体来源 |
| 1.2 主要实验试剂和实验材料 |
| 1.2.1 ELISA实验缓冲试剂 |
| 1.2.2 竞争性AlphaLISA实验缓冲试剂 |
| 1.2.2.1 T2-BSA偶联受体微球缓冲试剂 |
| 1.2.2.2 竞争性AlphaLISA实验用缓冲液 |
| 1.2.2.3 T-2毒素标准品稀释液 |
| 1.2.2.4 T-2毒素提取液 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 筛选最适反应条件 |
| 2.1.1 生物素标记抗体 |
| 2.1.2 竞争性酶联免疫吸附试验 |
| 2.2 AlphaLISA预实验 |
| 2.2.1 受体微球偶联T-2-BSA |
| 2.2.2 竞争性AlphaLISA反应体系及条件优化 |
| 2.3 T-2毒素竞争性AlphaLISA检测体系的建立 |
| 2.3.1 T-2毒素标准品对检测方法的评价 |
| 2.3.2 T-2毒素模拟样本对竞争性AlphaLISA检测方法的评价 |
| 2.3.3 T-2毒素商业化模拟样本对竞争性AlphaLISA检测方法的评价 |
| 2.3.3.1 T-2毒素商业ELISA试剂盒检测T-2毒素商业模拟样本 |
| 2.3.3.2 T-2毒素竞争性AlphaLISA方法检测T-2毒素商业模拟样本 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 T-2毒素标准品对T-2毒素竞争性AlphaLISA检测方法的评价 |
| 3.1.1 T-2毒素竞争性AlphaLISA检测方法加样顺序的选择 |
| 3.1.2 T-2毒素稀释试剂的选择 |
| 3.1.3 T-2毒素竞争性AlphaLISA检测方法标准曲线的建立 |
| 3.1.4 T-2毒素竞争性AlphaLISA检测方法的特异性评价结果 |
| 3.2 T-2毒素模拟样本对T-2毒素竞争性AlphaLISA检测方法的评价 |
| 3.3 T-2毒素商业化模拟样本对T-2毒素竞争性AlphaLISA检测方法的评价 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 文献综述 毒素蛋白检测技术研究进展 |
| 参考文献 |
（6）转录调节因子XtgS影响无乳链球菌毒力的机制研究及鱼源无乳链球菌超抗原的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 无乳链球菌概述 |
| 1 病原学 |
| 2 流行病学 |
| 3 毒力因子 |
| 4 调控因子的研究进展 |
| 4.1 单一调控因子 |
| 4.2 二元调控系统 |
| 4.3 真核型丝氨酸/苏氨酸激酶(STKs) |
| 5 XRE家族转录调节因子研究进展 |
| 第二章 链球菌超抗原的研究进展 |
| 1 链球菌超抗原的基本特征 |
| 2 链球菌超抗原的致病机理 |
| 3 链球菌超抗原的应用前景 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 XtgS互补株的构建及XtgS对毒力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ΔxtgS质粒互补株CΔxtgS~(pSET2-SPC-xtgs)的构建与鉴定 |
| 2.2 ΔxtgS原位互补株CΔxtgS~(xtgs)的构建与鉴定 |
| 2.3 ΔxtgS异位互补株CΔxtgS~(1-PxtgST)与CΔxtgS~(2-PxtgST)的构建与鉴定 |
| 2.4 Real-time PCR结果 |
| 2.5 野生株GD201008-001、缺失株ΔxtgS、互补株CΔxtgS对斑马鱼LD50及生存曲线的比较 |
| 3 讨论 |
| 第四章 XtgS过表达菌株(A909~(xtgs))的转录组分析及毒力变化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 A909~(xtgS)过表达菌株与A909~(pSET2)对照菌株的构建与鉴定 |
| 2.2 A909野生株、A909~(xtgS)过表达菌株与A909~(pSET2)对照菌株的转录组数据分析 |
| 2.3 Real-time PCR验证 |
| 2.4 A909野生株、A909~(xtgs)过表达菌株及A909~(pSET2)对照菌株的特性分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 XtgS蛋白的重组表达及其转录结合位点的确定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.2 凝胶阻滞试验(EMSA) |
| 2.3 β-半乳糖苷酶活性测定 |
| 3 讨论 |
| 第六章 鱼源无乳链球菌超抗原的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 小鼠攻毒试验 |
| 2.2 生物学信息预测 |
| 2.3 GD201008-001体外培养基培养的上清刺激淋巴细胞增殖效应 |
| 2.4 GD201008-001感染小鼠后分离的血清刺激淋巴细胞增殖效应 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文 |
（7）银白色葡萄球菌毒力基因预测和两个新型超抗原鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 银白色葡萄球菌的发现和研究现状 |
| 1.1.1 银白色葡萄球菌的发现过程 |
| 1.1.2 银白色葡萄球菌的物种特征 |
| 1.1.3 银白色葡萄球菌的最新研究进展 |
| 1.2 施韦策葡萄球菌的发现和研究现状 |
| 1.2.1 施韦策葡萄球菌的发现过程 |
| 1.2.2 施韦策葡萄球菌的物种特征 |
| 1.2.3 施韦策葡萄球菌的最新研究进展 |
| 1.3 银白色葡萄球菌和施韦策葡萄球菌研究的局限性 |
| 1.3.1 研究地区和人员有限 |
| 1.3.2 研究方法未形成体系 |
| 1.4 葡萄球菌超抗原简介 |
| 1.4.1 超抗原和肠毒素的联系和区别 |
| 1.4.2 葡萄球菌超抗原的结构与活性 |
| 1.4.3 葡萄球菌超抗原的种类与遗传位置 |
| 1.4.4 与葡萄球菌超抗原相关的疾病 |
| 1.4.5 葡萄球菌超抗原的分类鉴定及命名法 |
| 1.4.6 葡萄球菌超抗原对细菌本身的意义 |
| 1.5 泛基因组研究策略简介 |
| 1.5.1 泛基因组概念的提出 |
| 1.5.2 泛基因组的分析方法和软件 |
| 1.5.3 泛基因组分析的影响因素 |
| 1.5.4 泛基因组研究的指导意义 |
| 1.6 研究目的和思路 |
| 第二章 金黄色葡萄球菌复合群比较基因组学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 基因组数据下载和筛选 |
| 2.1.2 基于基因组数据的多位点序列分型(MLST) |
| 2.1.3 编码序列(CDS)的提取和筛选 |
| 2.1.4 使用Ortho MCL进行同源基因聚类 |
| 2.1.5 假基因和遗漏基因预测 |
| 2.1.6 泛基因组累积曲线模拟 |
| 2.1.7 直系同源簇(COG)聚类分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 基因组筛选 |
| 2.2.2 物种间基因组特征比较 |
| 2.2.3 物种间泛基因组比较 |
| 2.2.4 泛基因组各组分累积曲线模拟 |
| 2.2.5 泛基因组的直系同源簇(COG)聚类结果 |
| 2.2.6 金黄色葡萄球菌复合群的物种特异基因 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 基于非核糖体多肽合成酶基因鉴定银白色葡萄球菌 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 分子鉴定靶点筛选 |
| 3.1.2 引物设计与合成 |
| 3.1.3 主要培养基与试剂 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.1.5 分离株和标准菌株 |
| 3.1.6 分离株的菌落颜色观察 |
| 3.1.7 细菌基因组提取 |
| 3.1.8 多位点序列分型(MLST),16S rRNA和 rpoB基因鉴定 |
| 3.1.9 PCR反应体系和条件 |
| 3.1.10 PCR产物测序和序列分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 非核糖体多肽合成酶基因(NRPS)的筛选过程和特征分析 |
| 3.2.2 白色菌落分离株的筛选 |
| 3.2.3 疑似菌株NRPS基因扩增结果 |
| 3.2.4 疑似菌株的rpoB和16s rRNA基因鉴定结果 |
| 3.2.5 疑似菌株的多位点序列分型(MLST)验证 |
| 3.2.6 白色金黄色葡萄球菌的crtOPQMN检测结果 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 基于比较基因组学的银白色葡萄球菌毒力基因预测 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 银白色葡萄球菌基因组测序 |
| 4.1.2 基因组测序原始数据处理 |
| 4.1.3 基因组拼接与注释 |
| 4.1.4 参比基因组的选择 |
| 4.1.5 金黄色葡萄球菌复合群的泛基因组分析 |
| 4.1.6 系统发育树的构建 |
| 4.1.7 金黄色葡萄球菌复合群的群体结构分析 |
| 4.1.8 原噬菌体、SCCmec和 CRISPR-Cas元件分析 |
| 4.1.9 附属基因调控因子(agr)和荚膜多糖(CPS)基因簇分析 |
| 4.1.10 金黄色葡萄球菌复合群毒力基因预测 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 5株银白色葡萄球菌基因组测序结果 |
| 4.2.2 5株银白色葡萄球菌基因组拼接结果 |
| 4.2.3 金黄色葡萄球菌复合群种内和种间b ANI分析结果 |
| 4.2.4 金黄色葡萄球菌复合群基因组水平进化特征 |
| 4.2.5 金黄色葡萄球菌复合群群体结构特征 |
| 4.2.6 CRISPR-Cas和 SCCmec元件分析 |
| 4.2.7 附属基因调控因子(agr)基因簇特征 |
| 4.2.8 荚膜多糖(CPS)基因簇特征 |
| 4.2.9 金黄色葡萄球菌复合群的毒力基因分布 |
| 4.2.10 银白色葡萄球菌ST2250 的生物地理学特征 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 葡萄球菌超抗原SEl26和SEl27 的鉴定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 新型超抗原基因的生物信息学分析 |
| 5.1.2 菌株和Balb/c小鼠 |
| 5.1.3 主要试剂和培养基 |
| 5.1.4 主要仪器设备 |
| 5.1.5 细菌DNA提取和PCR反应 |
| 5.1.6 基因sel26和sel27 的转录表达分析 |
| 5.1.7 超抗原基因的克隆与异源表达 |
| 5.1.8 肠毒素超抗原的纯化 |
| 5.1.9 肠毒素超抗原的稳定性分析 |
| 5.1.10 肠毒素超抗原的活性测定 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 sel26和sel27 的分子特征和遗传背景 |
| 5.2.2 基因sel26和sel27 流行性和变异体 |
| 5.2.3 超抗原SEl26和SEl27 三维结构模拟 |
| 5.2.4 基因sel26和sel27 的转录表达分析 |
| 5.2.5 超抗原基因的克隆和异源表达 |
| 5.2.6 SEl26和SEl27 的稳定性分析 |
| 5.2.7 SEl26和SEl27 的刺激细胞增殖活性 |
| 5.2.8 SEl26和SEl27 的刺激细胞产生细胞因子活性 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第六章 主要结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 特色与创新 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 学术成果 |
| 致谢 |
（8）超抗原SEN和SEQ的初步晶体学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语 |
| 1 绪论 |
| 1.1 免疫应答机制 |
| 1.1.1 抗原 |
| 1.1.2 MHC |
| 1.1.3 TCR |
| 1.1.4 T细胞介导的免疫应答 |
| 1.2 超抗原 |
| 1.2.1 超抗原简介 |
| 1.2.2 超抗原特点 |
| 1.2.3 超抗原分类 |
| 1.2.4 超抗原介导的免疫应答 |
| 1.2.5 超抗原的生物学意义 |
| 1.2.6 超抗原SEN和 SEQ |
| 1.3 重组蛋白表达纯化策略 |
| 1.3.1 蛋白表达系统 |
| 1.3.2 蛋白纯化方法 |
| 1.4 蛋白晶体学 |
| 1.4.1 蛋白质结晶的原理及影响因素 |
| 1.4.2 蛋白质结晶方法 |
| 1.4.3 蛋白质晶体鉴定 |
| 1.4.4 蛋白晶体学的应用 |
| 1.5 本课题研究内容及意义 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 试剂盒 |
| 2.1.4 常规溶液的配置 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 表达载体的构建 |
| 2.2.2 重组蛋白的表达 |
| 2.2.3 可溶蛋白纯化 |
| 2.2.4 蛋白晶体的生长 |
| 2.2.5 数据处理、结构解析 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 SEN和 SEQ生物信息学分析 |
| 3.1.1 SEN和 SEQ理化性质分析 |
| 3.1.2 SEN和 SEQ二级、三级结构预测 |
| 3.1.3 SEN和 SEQ同源性分析 |
| 3.2 SEN和 SEQ表达载体构建 |
| 3.2.1 PCR结果 |
| 3.2.2 重组质粒构建结果 |
| 3.2.3 测序结果 |
| 3.3 SEN和 SEQ蛋白表达纯化 |
| 3.3.1 表达检测结果 |
| 3.3.2 GST柱亲和纯化结果 |
| 3.3.3 TEV酶切结果 |
| 3.3.4 Western blot检测结果 |
| 3.3.5 Mono Q纯化结果 |
| 3.3.6 Superdex200 纯化结果 |
| 3.4 SEN和 SEQ蛋白晶体筛选与优化 |
| 3.4.1 SEN和 SEQ蛋白晶体筛选结果 |
| 3.4.2 SEN和 SEQ蛋白晶体优化结果 |
| 3.5 SEN和 SEQ蛋白晶体X射线衍射与数据处理 |
| 3.5.1 SEN和 SEQ蛋白晶体鉴定结果 |
| 3.5.2 SEN和 SEQ蛋白晶体X射线衍射结果 |
| 3.5.3 SEN和 SEQ X射线衍射数据处理结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 蛋白质生物信息学预测分析 |
| 4.2 蛋白质表达纯化 |
| 4.3 蛋白质晶体生长 |
| 4.4 蛋白质结构解析 |
| 4.5 展望 |
| 5 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（9）超抗原SEB疫苗rS-H的研制及其免疫效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 金黄色葡萄球菌 |
| 1.2 SEs的超抗原性质 |
| 1.3 超抗原相关信号通路 |
| 1.4 超抗原与细胞应答 |
| 1.5 SEs相关肠胃疾病 |
| 1.6 SEB作为生物战剂应用的潜能 |
| 1.7 超抗原休克小鼠模型 |
| 1.8 超抗原的治疗策略 |
| 1.9 结核分枝杆菌热休克蛋白 |
| 第2章 融合蛋白rS-H的表达及纯化 |
| 2.1 材料、仪器及溶液配制方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.1.3 溶液配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 原核表达载体pET-28a-rS-H的构建 |
| 2.2.2 融合蛋白rS-H的表达、粗纯及相关工艺优化 |
| 2.2.3 融合蛋白rS-H的精纯及其相关工艺优化 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 重组表达质粒pET-28a-rS-H的鉴定 |
| 2.3.2 诱导表达条件及包涵体蛋白 rS-H 粗纯工艺条件优化结果 |
| 2.3.3 融合蛋白rS-H精纯及相关优化结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 融合蛋白rS-H的体液免疫效果研究 |
| 3.1 实验材料、仪器及溶液配制 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 仪器 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 体液免疫分组以及时间安排 |
| 3.2.2 腹腔攻毒及滴鼻攻毒模型毒素LD50的测定 |
| 3.2.3 SEB体内攻毒保护方案设计 |
| 3.2.4 体外抗体中和试验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 抗SEB特异性抗体滴度测定结果 |
| 3.3.2 腹腔攻毒试验与滴鼻攻毒实验LD50测定结果 |
| 3.3.3 SEB+LPS体内攻毒保护结果 |
| 3.3.4 体外抗体中和保护实验结果 |
| 3.3.5 组织病理切片分析结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（10）高效抗SEB中和保护性抗体的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 抗 SEB 中和保护性抗体的作用及其结构基础 |
| 一、抗 SEB 中和保护性抗体的作用及其结构解析 |
| （一）材料 |
| （二）方法 |
| （三）结果 |
| （四）讨论 |
| 二、抗 SEB 中和保护性抗体识别表位关键位点的确定 |
| （一）材料 |
| （二）方法 |
| （三）结果 |
| （四）讨论 |
| 第二部分 抗 SEB 中和保护性抗体的协同作用 |
| （一）材料 |
| （二）方法 |
| （三）结果 |
| （四）讨论 |
| 第三部分 高效抗 SEB 双可变区抗体的构建及功能鉴定 |
| （一）材料 |
| （二）方法 |
| （三）结果 |
| （四）讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
四、超抗原SED突变体的构建表达和鉴定（论文参考文献）
- [1]金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SED序列多态性及进化分析[J]. 王铜,陶晓霞,郭敏卓,孟凡亮,王多,张建中,王国庆,闫笑梅. 疾病监测, 2020(10)
- [2]超抗原与人TCR-CD3复合物的相互作用研究[D]. 孙世杰. 哈尔滨工业大学, 2020(01)
- [3]金黄色葡萄球菌肠毒素B人源性单克隆抗体的生物学特性研究[D]. 刘圆圆. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020
- [4]山羊源金葡菌的流行及其TSST-1诱导NLRP3炎症小体的激活[D]. 蒋佳利. 西南大学, 2020
- [5]11种毒素AlphaLISA检测体系的建立[D]. 张力文. 安徽医科大学, 2020(04)
- [6]转录调节因子XtgS影响无乳链球菌毒力的机制研究及鱼源无乳链球菌超抗原的筛选[D]. 高婷婷. 南京农业大学, 2019(08)
- [7]银白色葡萄球菌毒力基因预测和两个新型超抗原鉴定[D]. 张道锋. 上海交通大学, 2018
- [8]超抗原SEN和SEQ的初步晶体学研究[D]. 刘昭鑫. 武汉轻工大学, 2018(01)
- [9]超抗原SEB疫苗rS-H的研制及其免疫效果研究[D]. 侯天全. 吉林大学, 2016(09)
- [10]高效抗SEB中和保护性抗体的作用及其机制研究[D]. 王华菁. 第二军医大学, 2013(04)