一、基因及其表达调控中遗传密码选择的偏爱性（论文文献综述）
王思瑶[1]（2021）在《IGF-1 c.258A>G同义突变小鼠模型的构建及其功能解析》文中研究指明除环境、营养等因素的制约,动物的生长发育调控还受到长期的遗传选择,其中神经内分泌生长轴中的IGF-1基因被认为对机体生长发挥至关重要的作用。小型猪因独有的生理特性和其比例性矮小的体型而备受关注。为探究体型形成的潜在调控机制,课题组在观察到不同体型猪IGF-1表达差异的基础上,筛查出不同体型猪IGF-1基因外显子上仅有1个同义突变c.258A>G,并初步在细胞水平检测到了该同义突变对基因表达的影响。研究表明同义突变能够通过影响蛋白质合成过程中的多个方面来影响基因的表达,此外,还能通过改变新生肽链折叠方式进而在不改变氨基酸种类的前提下影响蛋白质的生物学功能。但目前对同义突变分子机制的解析仍局限于体外实验,因此,本实验首先构建动物单碱基突变模型旨在体内水平解析IGF-1基因同义突变c.258A>G的作用及作用机制。随着单碱基编辑技术的不断突破,本研究利用ABEmax碱基编辑器构建IGF-1 c.258A>G同义突变小鼠模型。鉴定基因型和脱靶情况后,稳定遗传至F2代小鼠。为探究该同义突变是否影响IGF-1基因表达,本实验分别用RT-q PCR和Western Blot检测野生型、杂合突变型以及纯合突变型小鼠在不同生长发育时期肝脏中IGF-1基因表达情况,并利用ELISA检测血清中IGF-1的分泌情况。实验结果发现相比较于野生型小鼠,6周龄和8周龄纯合突变小鼠肝脏IGF-1表达水平具有一定下降趋势,但无显着性差异（p>0.05）,而8周龄IGF-1 c.258A>G纯合突变小鼠血清中IGF-1分泌水平呈现出显着性降低（p<0.05）。与此同时,监测F2代野生型、杂合突变型以及纯合突变型小鼠的生长曲线以及体长情况,计算8周龄小鼠的脏器指数,并利用X射线和组织形态学染色观察其骨骼发育情况。检测结果表明,各基因型小鼠的生长发育和全身骨骼未发现显着性差异,股骨骨骺和生长板发育也没有异常或畸形的表现,推测该同义突变对IGF-1含量的下调程度不大,可能受到其它代偿效应的弥补,因而不足以引起机体的生长发育和体型性状较大的波动。基于该同义突变所在密码子编码的氨基酸为丙氨酸（Ala）,本研究为探索t RNA种类和丰度以及序列上下文是否影响同义密码子的功能,将四种同义密码子替换IGF-1成熟肽序列中的所有Ala,另外互换GCG和GCA两种同义密码子的位置,并以普遍的大型猪种中IGF-1成熟肽序列为野生型作为对照。最终成功构建6组携带不同Ala同义密码子的IGF-1重组表达载体,并在重组IGF-1的C末端加入FLAG标签。分别将不同表达载体转染至PK-15细胞中,RT-q PCR和Western Blot检测细胞内FLAG的表达量。结果显示,四种同义密码子编码的IGF-1表达水平与t RNA丰度和密码子偏爱性趋势相一致,但均低于IGF-1-WT组的表达量（P<0.05）。为进一步探究不同Ala同义密码子影响IGF-1蛋白质合成的分子机制,本研究检测了mRNA二级结构和稳定性。结果表明,不同同义密码子组合编码的IGF-1具有不同的mRNA二级结构,并影响IGF-1转录和翻译水平的稳定性。除IGF-1-GCT组呈现出的IGF-1 mRNA衰减趋势与IGF-1-WT组基本一致外,其他组的mRNA稳定性都在一定程度上高于IGF-1-WT组。此外,在蛋白质水平上,根据蛋白质翻译起始速率和蛋白质半衰期的检测结果表明,携带不同Ala同义密码子的IGF-1蛋白质合成起始速率也各不相同。IGF-1-WT组的IGF-1蛋白质半衰期最短,而IGF-1-GCG组和IGF-1-GCC组的稳定性显着高于IGF-1-WT组（P<0.05）。进一步,为验证IGF-1基因编码区上的Ala同义突变替换是否干扰基因的生物功能,CCK-8实验结果显示各表达载体编码的IGF-1能够影响PK-15细胞的增殖情况。综上,本研究在动物水平上评估了潜在参与体型形成的关键基因IGF-1上同义突变c.258A>G对个体表型和基因表达及分泌的影响程度,进一步探索了同义密码子影响基因表达和生物学功能的分子机制。我们认为虽然不同同义密码子的使用具有偏好性,但最优的组合能够使得基因在表达、稳定性和生物学功能上维持相对优势的平衡。
田明明[2]（2019）在《高致病性冠状病毒密码子偏爱性分析及S蛋白真核表达重组质粒的构建》文中研究说明目的密码子偏爱性分析已成为多种学科研究的热点问题与前沿方向。在医学病毒学的研究领域里,密码子偏爱性分析常用来了解不同病毒株间进化关系,明确它们之间的遗传特性,进而为疾病的防控与疫苗的研制方面提供重要的理论基础。本课题分析六种人冠状病毒（HCoV:SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1）的密码子偏爱性,了解它们之间的进化关系;又分析不同宿主间高致病性冠状病毒（SARS-CoV、MERS-CoV）的密码子偏爱性及它们的进化关系,以明确高致病性冠状病毒的遗传特性,为其防控提供重要的理论依据。同时利用分子克隆技术构建高致病性冠状病毒不同长度的S蛋白（SARS-S、SARS-S1、SARS-RBD、MERS-S1、MERS-RBD）的真核表达重组质粒,为进一步S蛋白表达及功能研究奠定一定的理论基础。方法本研究,从NCBI下载了所需的冠状病毒基因编码序列（CDS）,使用Lasergene子程序EditSeq保存截取的蛋白编码序列;使用EMBOSS子程序CUSP计算密码子Frequency值;CodonW计算密码子ENC、GC、GC3S、RSCU值。使用ENC、RSCU指标,衡量密码子偏好性;用ENC-Plot、中性绘图分析、PR2分析、聚类分析的方法,分析密码子偏爱性的影响因素,以及它们之间的进化关系。同时,我们利用分子克隆技术构建高致病性冠状病毒不同长度的S蛋白（SARS-S、SARS-S1、SARS-RBD、MERS-S1、MERS-RBD）的真核表达重组质粒。结果1.六种HCoV密码子偏爱性分析结果显示:各蛋白ENC平均值均接近61;通过RSCU平均值的分析,找出了六种HCoV各蛋白间的偏爱性密码子（RSCU>1）与非偏爱性密码子（RSCU<1）,其中各HCoV偏爱性密码子均以A、U结尾的密码子为主;ENC-Plot结果显示,六种HCoV各蛋白几乎落在了相似区域,且远离标准曲线;中性绘图分析结果显示,六种HCoV所有蛋白斜率（b）除HCoV-NL63斜率较大（0.7267）,其他斜率均较小;奇偶规则分析结果显示,大部分基因落在了左下方。另外,基于结构蛋白S与非结构蛋白ORF1ab的密码子偏爱性聚类结果显示,在S蛋白上,HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-229E聚为一起;而HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV聚在了一起;ORF1ab结果显示,SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-HKU1聚在了一起,MERS-CoV单独聚为一类。2.SARS-CoV与SARSr-CoV密码子偏爱性比较及聚类分析结果显示:两者各蛋白有效密码子数目（ENC）平均值均接近61;SARS-CoV编码的各蛋白偏爱的密码子（RSCU>1）个数在20-27之间,SARSr-CoV编码的各蛋白偏爱的密码子（RSCU>1）个数在17-30之间,并且两者皆以A、U结尾的密码子为主;其中,AUU、ACU为SARS-CoV的12种蛋白共有的偏爱密码子,而GGG、UGG、CUG、AUC、AUG为非偏性密码子。另,CUU为SARSr-CoV的12种蛋白共有的偏爱密码子,而GGG、UGG、AGC、CGG为非偏性密码子;ENC-Plot结果显示,两者几乎落在了相似区域,且远离标准曲线;中性绘图分析结果显示,SARS-CoV与SARSr-CoV的S、ORF1a两蛋白的斜率均较小;奇偶规则分析结果显示,大部分基因落在了左下方。基于密码子偏爱性的聚类分析结果显示,在S蛋白上,SARSr-CoV/RSYN2013/Yunnan、SARSr-CoV/RS/WIVI1/Yunnan/2013、SARSr-CoV/Rs/WIV16/Yunnan/2013三株与SARS-CoV进化关系最为密切。而RS7327、RS9401、RS4084、RS4231、RS4874这5株新报道的SARSr-CoV同样可与SARS-CoV聚为一类;而新近发现的RS4081、RS4255、AS6526、RS4237、RS4247、Rf4092这6株SARSr-CoV则与华南地区（香港、广西）发现的SARSr-CoV聚为一类;云南株YNLF31C、YNLF34C、RS3367与中国西南（贵州、广西）、华中（湖北）、华北（河北）、东北（吉林）发现的病毒株聚在了一起,同时,地域相邻的山西、陕西则单独聚为一类。而非结构蛋白ORF1a的聚类分析发现,云南蝙蝠中发现的SARSr-CoV均与可以感染人和果子狸的SARS-CoV聚在了一起,同时,该分支同时包括了来自于贵州、广西、湖北的毒株。而香港报道的SARSr-CoV毒株与SARS-CoV差异较大,与一株来自湖北的毒株共同聚为一类。中国中北部地区的山西、陕西、河北、湖北、吉林的SARSr-CoV则共同聚为一类。3.MERS-CoV密码子偏爱性分析及聚类分析结果显示:Human-MERS-CoV和Camel-MERS-CoV的ENC平均值均接近61;Human-MERS-CoV编码的各蛋白偏爱的密码子（RSCU>1）个数在29-31之间,Camel-MERS-CoV编码的各蛋白偏爱的密码子（RSCU>1）个数在29-32之间,并且两者皆以A、U结尾的密码子为主;其中,UUU、UUG、CUU、AUU、UCU、CCU、CAU、AAU、GAA、CGU、AGU、AGG、GGU为Human-MERS的11种蛋白共有的偏爱密码子,而UUC、CUC、CUA、AUC、GUC、GUA、UCC、CCC、ACC、ACG、GCC、UAC、CAC、GAC、UGC、CGC、CGA、AGC为Human-MERS的11种蛋白共有的非偏性密码子。另,UUU、UUA、UUG、AUU、GUG、UCU、UCA、CCU、CCA、ACU、ACA、GCU、GCA、UAU、CAA、GAA、UGU、AGU、AGA、AGG、GGU为Camel-MERS-CoV的11种蛋白共有的偏爱密码子,而UUC、CUC、CUA、AUC、AUG、GUC、UCG、CCC、CCG、ACC、ACG、GCC、GCG、UAC、UAG、UCC、CAC、CAG、GAG、UGC、UGG、CGC、CGA、CGG、AGC、GGG为Camel-MERS-CoV的11种蛋白共有的非偏性密码子;ENC-Plot结果显示,两者几乎落在了相似区域,且远离标准曲线;中性绘图分析结果显示,Human-MERS-CoV与Camel-MERS-CoV各蛋白中均较小。奇偶规则分析结果显示,大部分基因落在了左下方。聚类分析结果显示,2012-2018年,Camel-MERS-CoV偏爱性与Human-MERS-CoV相似,几乎在每条蛋白上都可看到两者聚在一起的流行株。而MERS-CoV ORF8b蛋白的密码子偏爱性相对稳定并单独聚为一类,即Human-MERS-CoV与Camel-MERS-CoV单独聚类。但从流行时间的内部去剖析,发现2017年的Camel-MERS-CoV流行株,在许多内部蛋白中（E、ORF1a、ORF1ab、ORF4a、ORF5、ORF8b）,都聚在了距离其他年份（2012-2016）较远的位置;其中,在E和ORF1ab两种蛋白中,其与2011年Bat-MERS-CoV很好地聚在了一起;同时2017年Camel-MERS-CoV在S、M、ORF4b蛋白上,又和Human-MERS-CoV聚为了一类。而在Human-MERS-CoV中,除了ORF1ab与ORF8b两种蛋白之外,2018年的Human-MERS-CoV与Camel-MERS-CoV（2012-2016）均具有极其相近的聚类关系;同时更有趣的是,在MERS-CoV的ORF4b蛋白中,2015-2017年,各年份下Human-MERS-CoV和Camel-MERS-CoV均聚为一起。4.本研究利用分子克隆技术成功构建出高致病性冠状病毒S蛋白（SARS-S、SARS-S1、SARS-RBD、MERS-S、MERS-S1、MERS-RBD）的真核表达重组质粒。结论1.六种HCoV的密码子偏爱性均较弱,偏爱性密码子均以A、U结尾为主;六者在进化过程中受自身突变与自然选择双重因素影响,且以自然选择为主;由4个密码子编码的氨基酸的第3位碱基中,C和T（嘧啶）的使用频率高于G和A（嘌呤）,其中,高致病性冠状病毒（SARSr-CoV、MERS-CoV）嘧啶、嘌呤均使用,而普通HCoV（HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、HCoV-OC43）几乎不使用G和A（嘌呤）;密码子偏爱性的聚类分析结果显示,六者的聚类关系与基于它们的基因组的进化树结果不同。2.SARS-CoV与SARSr-CoV密码子偏性较弱,且偏爱的密码子均以A、U结尾为主。两者在进化过程中同时受自身突变和自然选择双重因素影响,其中,以自然选择为主;由4个密码子编码的氨基酸的第3位碱基中,C和T（嘧啶）的使用频率高于G和A（嘌呤）,且其频率存在显着偏倚;SARSr-CoV的密码子偏爱性与它们的地理位置有关,相近地区的SARSr-CoV能较好的聚类;云南蝙蝠SARSr-CoV可能是SARS-CoV、及其他地区SARSr-CoV重要的天然基因库;云南SARSr-CoV跨物种感染人的可能性需要引起我们的重视。3.Human-MERS-CoV与Camel-MERS-CoV的密码子偏爱性均较弱,两者偏爱的密码子以A、U结尾为主;两者在进化过程中同时受自身突变和自然选择双重因素影响,其中,以自然选择为主。PR2分析结果显示,密码子的第三位C和T（嘧啶）的使用频率高于G和A（嘌呤）,且其频率存在显着偏倚。同时,基于密码子偏性的聚类分析发现,Human-MERS-CoV偏爱性与Camel-MERS-CoV相似,两者进化关系比较相近。2017年,Camel-MERS-CoV可能发生了变异。近三年ORF4b蛋白,Human-MERS-CoV与Camel-MERS-CoV具有极其相近的聚类关系;而ORF8b两者又单独聚类,呈现出密码子偏性比较稳定的聚类特征。因此,ORF4b与ORF8b可能是我们防控MERS的关键蛋白。4.本研究利用分子克隆技术成功构建出高致病性冠状病毒不同长度的S蛋白（SARS-S、SARS-S1、SARS-RBD、MERS-S、MERS-S1、MERS-RBD）的真核表达重组质粒,为进一步S蛋白表达及功能研究奠定一定的理论基础,能够为进一步S蛋白表达及功能研究奠定一定的理论基础。
吴彦庆[3]（2019）在《托桂型芍药花型形成的相关基因筛选及其调控机制研究》文中提出芍药（Paeonia lactiflora Pall.）,和牡丹一样,是我国传统名花。长期的人工选择培育出若干色彩、花型变异丰富的栽培品种,使其具有极高的观赏价值。前人研究表明,芍药的花型的变化主要来源于雌、雄蕊的瓣化和花瓣数目的自然增加两个方面,但对于芍药花型形成相关的分子机制缺乏较为深入的研究。鉴于此,本研究以芍药花型中较为特殊的托桂型开展研究,以托桂型品种‘紫凤羽’内、外花瓣组织为材料,通过比较（无参）转录组学和蛋白质组学联合分析来筛选芍药花型调控的相关基因;在此基础上,对重要候选基因APETALA2（PlAP2）进行RACE克隆、生物信息学分析、基因表达特性以及启动子区甲基化调控等功能验证,同时从密码子偏好性层面入手,利用多元统计分析探讨芍药转录组及该关键候选基因密码子使用模式。主要研究结果如下:1.芍药‘紫凤羽’内、外花瓣组织RNA-seq 比较转录组分析芍药‘紫凤羽’内、外花瓣的组织RNA-seq转录组测序结果显示,共获得394.46 Mb个读长（cleanreads）,43,704个具有功能注释的非重复序列基因（Unigenes）,内、外花瓣两组之间存在979个差异表达基因（DEGs）,其中外瓣组上调408个DEGs。GO功能分析表明,DEGs主要在代谢途径、单细胞途径、细胞器和膜结构、酶催化活性和分子结合等富集程度较高;KEGG通路富集分析显示,DEGs主要在信号转导、次生代谢生物合成、糖类代谢、萜类与聚酮化合物代谢等通路中富集程度较高,并筛选出PISTILLATA（PI）、APETALA2（AP2）,Agamous-like MADS-box UGL6)、AGAMOUS（AG）等重要花器官发育相关基因。2,芍药‘紫凤羽’内、外花瓣组织iTRAQ比较蛋白质组学分析及候选基因筛选（1）芍药‘紫凤羽’内、外花瓣组织的iTRAQ蛋白质组学分析显示,两组之间共筛选出266个差异表达蛋白（DEPs）,其中外瓣组上调115个DEPs。GO功能分析显示,DEPs主要参与生物学过程分类中的代谢途径（131 DEPs）、单细胞途径（102 DEPs）,细胞组成分类中的细胞外基质（12 DEPs）、液泡（12 DEPs）,分子功能分类中的酶催化活性（137 DEPs）。KEGG通路富集分析显示,DEPs主要富集在10个重要信号通路,其中包括生物氧化、糖酵解和糖异生等,并筛选出丙酮酸脱羧酶（PDC2）、醛脱氢酶家族（ALDH3F1、ALDH2B7）、花分生组织决定蛋白（APETALA2）等重要差异表达蛋白。（2）基于转录组和蛋白质组学分析结果,利用Venny软件在芍药‘紫凤羽’内、外花瓣组织间筛选出39个共同差异表达基因/蛋白质,主要参与生物氧化（Biological oxidations）、糖酵解和糖质新生（Glycolysis/Gluconeogenesis）、光合作用碳固定（Carbon fixation in photosynthetic organisms）、丙酮酸代谢（Pyruvate metabolism）等信号通路。qPCR验证发现,APETALA2、ALDH3F1、PDC2、NLTP6、At1g22430基因在芍药内、外花瓣中表达差异极显着（P<0.01）,进一步对APETALA2基因进行western blot验证显示,芍药‘紫凤羽’外瓣组织P1AP2蛋白表达水平明显高于内瓣组织。综合表明,APETALA2（AP2）可以作为调控芍药托桂型品种花型的关键候选基因之一,有必要对其调控作用及其机制开展分析探讨。3.芍药APETALA2（PlAP2）基因克隆及表达特性分析（1）RACE技术克隆获得芍药PlAP2基因cDNA序列全长1935 bp,其完整的开放阅读框（ORF）为1578 bp,编码525个氨基酸。蛋白结构与功能分析表明,P1AP2蛋白为亲水性不稳定蛋白,无跨膜结构和信号肽,为非分泌蛋白;核定位信号位于氨基酸序列139-KKSRRGPRS-147;二级结构包括 α 螺旋（24%）、β 折叠（19%）、β-转角（28%）和无规则卷曲（28%）;存在8个糖基化位点和64个磷酸化位点,包含2个相同的保守结构域:AP2/（Ethy1ene-Responsive factors,ERF）（151-213aa 和 243-306aa）;亚细胞定位主要在细胞质（45.0%）中,少量分布于微体、线粒体基质间隙和溶酶体;进化树分析表明,芍药PlAP2与牡丹高度同源且亲缘关系最近。（2）利用qRT-PCR检测PlAP2基因在不同芍药托桂型品种（‘紫凤羽’、‘彤云金焰’、‘红楼锦菊’）4个不同发育时期（花蕾期S1、初开期S2、盛开期S3、衰败期S4）中内、外花瓣表达情况,结果显示,PlAP2基因在‘紫凤羽’外瓣组织中表达水平显着高于内瓣,盛开期S3表达水平均显着高于花蕾期S1、初开期S2、衰败期S4,‘彤云金焰’表达量均显着高于‘红楼锦菊’和‘紫凤羽’品种。此外,本研究发现芍药‘紫凤羽’不同发育时期以及不同品种（‘紫凤羽’、‘彤云金焰’、‘红楼锦菊’）间的花瓣形态特征均存在明显差异,综合表明PlAP2基因表达水平与芍药花瓣发育密切相关。4.芍药花型调控候选基因APETAIA2（PlAP2）启动子区甲基化修饰分析利用染色体步移克隆获得芍药PlAP2基因5’端上游启动子区2000 bp,并且包含1个CpG岛（-665 bp～-872 bp）,该区域包括NF-kappaB、GATA-1、Sp1、C/EBP等重要转录因子结合位点;BSP+Miseq甲基化测序显示,PlAP2基因启动子CpG岛区域存在7个CpG 位点（CpG-1、CpG-2、CpG-3、CpG-4、CpG-5、CpG-6、CpG-7）,并且发生不同程度的甲基化修饰（19.73%～65.78%）。内瓣与外瓣组织甲基化程度差异显着性分析显示,CpG-3位点在内瓣组织中甲基化比例（45.37%）极显着高于外瓣组织（35.85%）。不同发育时期甲基化程度差异显着性分析显示,CpG-2位点在衰败期S4中甲基化比例（57.01%）极显着高于盛开期S3（40.62%）,显着高于花蕾期S1（45.49%）和初开期S2（45.85%）;CpG-3位点在盛开期S3中甲基化比例（32.36%）显着低于花蕾期S1（42.99%）、初开期S2（43.71%）以及衰败期S4（43.37%）;CpG-3、CpG-6位点甲基化程度与mRNA表达均表现为极显着的负相关,其中CpG-3位于Sp1转录因子结合位点上。5.芍药转录组及APETALA2（PlAP2）密码子使用模式分析（1）基于芍药托桂型品种‘紫凤羽’转录组测序筛选的43,704个Unigenes,并根据CDS序列特征和大于300 bp原则进行过滤后最终获得的24,216个基因序列作为芍药转录组密码子研究对象,利用Mobyle软件计算GC含量、第1与2位密码子的平均GC含量（GC12）、第3位密码子的GC含量（GC3s）、有效密码子数ENC、密码子适应指数CAI、相对同义密码子使用度RSCU等密码子偏性指标,其次进行中性绘图（GC12 vs.GC3）、ENC-GC3s绘图以及PR2（Parity Rule 2）绘图分析,并运用多元统计分析方法探讨突变压力和选择作用对密码子使用模式的影响程度,最后以5%CAI值作为高、低表达样本组,计算这两个样本组的同义密码子相对使用度,利用卡方检验分析两组之间的显着性差异来确定最优密码子。结果显示,芍药转录组密码子GC3s含量为41.8%,大部分基因GC含量主要分布在35%～45%;中性绘图分析表明GC3s与GC12呈极显着的负相关（r=-0.03,P<0.01）;ENC-GC3s绘图表明大部分基因分布在标准曲线周围,也有一部分基因分布在标准曲线下方较远的位置,同时大部分基因（ENCexp-ENCobs）/ENCexp 比值集中分布在-0.1-0.3;PR2绘图分析显示密码子第3位T的使用频率高于A,G使用频率高于C,表明嘌呤（A和G）与嘧啶（T和C）的使用频率并不均衡;对应性分析COA（Correspondence Analysis）表明,第一轴上显示了 20.55%的差异,其他3个轴分别为13.99%、12.24%、11.45%,表明芍药转录组密码子使用模式评价以第一轴（Axis 1）为主;突变压力和选择作用分析发现,第一主轴与GC3s、CAI的相关系数均达到极显着正相关（r=0.758,P<0.01;r=0.293,P<0.01）;利用ΔRSCU和卡方显着性检验的方法,确定了 22个为芍药转录组最优密码子,其中大部分以A或U结尾。（2）基于组学联合分析筛选的芍药花型调控重要候选基因—APETALA2（AP2）,利用R软件计算核苷酸组成（GC含量）和遗传指数如有效密码子数（Effective number of codons,ENC）、同义密码子相对使用度（Relative synonymous codon usage,RSCU）、相对密码子使用偏好性（Relative codon usage bias,RCBS）等,来分析比较不同植物AP2基因密码子使用模式中密码子偏好性和碱基组成动力学。结果显示,不同植物AP2基因密码子使用受到GC偏好性（GC bias）影响,特别是GC3s;整体碱基组成分析暗示芍药等不同植物AP2基因编码序列中密码子AT使用频率高于GC,并且大多数偏好使用以A/T结尾;芍药等不同植物中AGA、GCU和UGU均表现为较高的RSCU值,为最优势密码子;芍药（Paeonia lactiflora）和牡丹（Paeonia suffruticosa）植物AP2基因的密码子使用特点相似;AP2基因选择压力分析显示,具有较低的最优密码子频率（FOP）值和相对密码子偏好性（RCBS）值、较高的有效密码子数（ENC）值,表明芍药等不同植物AP2基因在密码子使用中具有一个较低偏好性。
吴恒[4]（2019）在《解脂耶氏酵母促进菌丝形成转录因子Mhy1的启动子、靶基因及结合位点的鉴定》文中研究指明一些种类的真菌能够在卵圆形的酵母形态与丝状的菌丝形态之间相互转换,这称为二型性转换,这一过程可被多种环境因素所诱导,包括温度、pH、碳源的可利用情况及一些特殊的营养物质等。二型性转换被认为是真菌应对营养匮乏等环境压力的一种应答反应。二型性转换调控机制的研究对于揭示真菌如何适应环境具有重要的科学意义,对于二型性病原真菌的预防及治疗也具有重要的指导作用。解脂耶氏酵母是一种无致病性的非传统型酵母,能够以烷烃、脂肪酸和油脂作为唯一碳源生长,具有良好的脂质降解及代谢产物分泌能力,在工业生产上具有广泛的应用。在进化上,解脂耶氏酵母与酿酒酵母和白色念珠菌亲缘关系较远,但是同酿酒酵母与白色念珠菌相似,也能在一些环境因子（如氮源缺乏、血清、中性pH等）的诱导下发生二型性转换,我们对它的二型性转换过程很感兴趣,希望能够揭示其调控机制。锌指转录因子在真核生物中广泛存在,其中,Msn2/4家族C2H2型锌指转录因子在酿酒酵母中通过结合下游靶基因启动子中的STRE,调控一系列靶基因的转录表达,在压力抵抗、糖酵解及脂肪酸代谢等方面发挥着重要的调控作用。白色念珠菌中Msn2/4家族成员Mnl1在弱酸抵抗中发挥作用。解脂耶氏酵母中Msn2/4家族成员Mhy1参与对二型性转换的调控,而酿酒酵母Msn2/4和白色念珠菌Mnl1均不调控该细胞学功能,显示出Mhy1在细胞学功能上与其它Msn2/4家族成员存在差异。我们对解脂耶氏酵母的Mhy1及其同源蛋白YlMsn4进行研究,通过基因敲除与过量表达,鉴定了这两个锌指转录因子的细胞学功能。发现Mhy1对解脂耶氏酵母的菌丝形成具有重要的促进作用,Mhy1缺失后细胞丧失菌丝形成能力,细胞维持在酵母形态;其过量表达会显着促进菌丝的形成,而野生型对照菌株在此条件下仅呈卵圆型的酵母形态。Mhy1对于解脂耶氏酵母的侵入性生长也具有显着的正调控作用,它的缺失及过量表达分别造成侵入性生长的减弱与增强。Mhy1对于解脂耶氏酵母脂肪酶及蛋白酶的分泌具有明显的抑制作用,推测Mhy1参与脂质及蛋白质的代谢调控。此外,Mhy1并不在压力抵抗中起明显作用。它与酿酒酵母和白色念珠菌中Msn2/4家族成员在功能上的差别显示出Mhy1在功能与调控的靶基因方面发生了趋异进化。解脂耶氏酵母YlMsn4尚未被研究报道,我们发现YlMsn4并不参与二型性转换的调控,它的缺失及过量表达并没有造成细胞形态的变化,但是它参与解脂耶氏酵母对酸胁迫的应答,YlMSN4缺失突变体在酸性培养基中生长变慢,细胞变大变圆,显示出与酿酒酵母Msn2/4及白色念珠菌Mnl1同源蛋白功能上的保守性。我们对mhy1?突变体进行MHY1基因回补时,发现MHY1的启动子远长于一般的看家基因启动子,含有1269 bp和1302 bp长度启动子的MHY1基因完全不能够回补mhy1?突变体的菌丝形成缺陷,启动子1338 bp开始出现微弱的回补效果,至2574 bp长度的启动子回补效果依旧微弱,启动子长度达到2895 bp或者3716 bp时回补效果增强,但是仍然不能达到完全回补的水平,直到将启动子延长至3759 bp或者更长时,才能达到与野生型菌株菌丝形成能力一致。该实验结果显示MHY1启动子长度较长,接近4000bp,推测MHY1的转录表达可能受到严格的调控。我们在MHY1启动子中鉴定出一个增强子序列UAS1（-3759 bp至-3449 bp）和一对STRE二联体（-881 bp至-871 bp）,这两个元件对于MHY1的表达具有重要作用。UAS1能够显着提高启动子的转录活性,增强回补效果。我们通过EMSA测试发现Mhy1能够结合STRE二联体,调控MHY1自身的表达。鉴于Mhy1对解脂耶氏酵母二型性转换具有重要的调控功能,我们对野生型菌株、mhy1?突变体和过量表达MHY1菌株进行了转录组测序,以揭示Mhy1调控二型性转换机制。转录组测序发现了数量众多的受Mhy1调控的靶基因,以表达水平差距为1倍的显着差异标准进行统计,在mhy1?突变体有456个基因显着下调,126个基因显着上调。过量表达MHY1菌株中有170个基因显着下调,530个基因显着上调,推测Mhy1主要作为正转录调控因子发挥作用。通过对差异基因进行功能聚类,发现Mhy1正调控基因中,细胞壁蛋白及细胞壁形成相关酶类的编码基因出现最明显的富集,推测Mhy1通过调控靶基因中最主要的细胞壁功能相关基因的表达,来调控菌丝的发育。我们通过EMSA测试了一些Mhy1靶基因启动子所含有的STRE元件结合Mhy1的能力,并且对测试的STRE进行突变,检测STRE突变对启动子转录活性的影响,最终鉴定出4个受Mhy1直接调控的靶基因:细胞壁蛋白基因YALI0C23452g、尚未发现明确功能的YALI0C15268和YALI0B09955以及MHY1自身。我们还确定了这些靶基因启动子中的Mhy1结合位点,发现位于STRE元件（AGGGG）5’端的两个碱基,尤其是第二位碱基,对于Mhy1的结合有着重要作用,研究结果显示Mhy1结合靶位点的一致序列为WNAGGGG（W=A或T;N=A、T、C或G）。Mhy1结合位点的发现将会更好地指导人们鉴定受Mhy1直接调控的靶基因,具有重要的价值。
郭平安[5]（2018）在《温度影响苎麻纤维品质转录组解析及特异型启动子鉴定》文中研究说明苎麻一般一年收获三季,多项研究均发现不同季节苎麻纤维品质尤其是纤维细度存在明显差异,然而其生理和分子机理却鲜有报道。苎麻是韧皮纤维作物,通过生物技术对其纤维品质进行定向改良亟需开发韧皮部特异（优势）表达启动子。随着转录组学在苎麻研究领域的不断应用,已经积累了大量具有研究价值的候选基因,这些基因的功能验证工作及后续应用也都需要用到启动子。基于这些问题,本研究联合二代高通量测序和三代全长转录组测序在转录水平上解析不同温度模式下苎麻纤维品质存在差异的原因,同时对韧皮部蛋白（PP2）家族进行鉴定和表达分析以及分离了5个苎麻内源启动子并在拟南芥中进行了功能分析。主要实验结果如下:1.不同温度模式下苎麻茎皮转录组研究本研究对两种温度模式（High Temperature Patterns,HTP;Low Temperature Patterns,LTP）下苎麻茎皮上、中、下三个部位进行二代转录组测序并分别混合HTP和LTP样品进行三代转录组测序,并以三代测序结果为参考序列进行后续分析。通过全长转录组测序我们一共获得353495个转录本及139530个基因,其中转录本N50长度在3000 bp以上,测序质量较好,同时二代测序clean reads的mapped率均大于83%,mapped效率较高。差异表达分析显示:茎皮上部、中部和下部差异基因数目分别为:3791、7160和3277。通过分析HTP与LTP处理下苎麻表型差异及相关基因表达模式,揭示温度影响苎麻纤维细胞大小的可能调控机制:HTP处理使expansin、extensin等基因上调而导致细胞壁松弛、细胞膨胀;HTP也使pectin methyltransferase基因上调并抑制pectin methylesterase inhibitor表达,导致细胞壁果胶成分降解加剧,降解果胶产生的果胶酸形成局部酸性环境,而酸性环境则可能刺激expansin活性,加剧细胞不可逆膨胀,从而导致纤维细胞增大、纤维增粗。此外,温度影响苎麻化学成分的机制十分复杂,从测序结果中我们推测温度可能是通过影响cellulose synthase、cellulose synthase-like、xyloglucan glycosyltransferase、pectin methylesterase、pectin methylesterase inhibitor、COMT、CAD和PAL等基因的表达使苎麻纤维化学成分发生改变从而影响纤维品质。2.苎麻PP2家族基因鉴定与表达分析本研究一共鉴定了15个BnPP2基因并系统性分析了它们的表达模式。BnPP2基因在苎麻茎皮和叶柄中响应高低温胁迫呈现规律性变化,高温处理使叶柄中所有BnPP2基因上调,而低温处理使茎皮中所有BnPP2基因上调。BnPP2基因对生物胁迫更敏感,虫害处理能显着诱导BnPP2基因表达,特别是BnPP2-7、BnPP2-8、BnPP2-9、BnPP2-10和BnPP2-15,其中BnPP2-15的启动子活性也受到机械损伤和虫害诱导。这些结果为BnPP2基因功能的解析提供了参考,也为将来进一步研究这些基因是否具有抗虫潜力提供了基础。3.苎麻组织特异型启动子克隆本研究采用UFW方法克隆到五个苎麻内源启动子,分别是BnPP2pro-15-2086、BnGDSpro-1872、BnSTMpro-1417、BnSUS1pro-1690和BnSUT2pro-2239。对各启动子进行合适截短并在拟南芥中进行功能分析,结果显示:BnGDSpro-487具有的维管组织特异性;BnSTMpro-1417及其截短片具有顶端分生组织特异性;BnSTMpro-1233具有根尖特异性而BnSTMpro-425具有根结特异性;BnGDSpro和BnSTMpro的活性受CuSO4处理诱导;BnSUS1pro-1690和BnSUS1pro-1420呈现出维管组织特异性功能;BnSUT2pro-2239及其截短片段(除BnSUT2pro-231外)为组成型且受伤害诱导启动子。本研究为阐明温度影响苎麻纤维品质的分子机理奠定了基础,也为后续苎麻分子遗传改良提供了大量候选基因,同时还扩充了植物启动子数据库,为植物基因工程提供更多启动子选择。
吴庆燕[6]（2017）在《猪IGF1R外显子SNPs筛查及IGF1R胞内结构域SNPs对其表达水平的影响》文中研究说明巴马香猪（Bama minipig,BM）是我国独有的小型猪品种,作为矮小品系,在其培育过程中形成了许多独特的遗传标记,例如肉眼可见的“体型矮小”这一形态学标记,即身体所有部位在尺寸上均减少,与大型猪（Large pig,LP）相比均成比例,其可能由生长激素（GH）分泌不足造成,受GHRH-GH-IGF1轴的调控。IGF1R是该轴的细胞膜受体之一,是细胞内级联反应的效应分子,IGF1须与IGF1R结合才能激活细胞内信号通路（MAPK、PI3K等信号通路）,使靶组织发挥调节生长发育的作用。很多研究证明IGF1R上的多态性会影响机体的生长性状,同时,IGF1R是调节猪出生后生长及胴体组成性状的潜在候选基因。本研究从筛查巴马香猪、大型猪（大白猪、长白猪、杜洛克）IGF1R基因外显子上的SNP位点入手,分析不同猪种IGF1R上的SNPs位点是否影响m RNA转录和蛋白质翻译。在巴马香猪、大白猪、长白猪、杜洛克IGF1R基因21个外显子上共筛查到9处SNPs位点,且均为同义突变,分别为g.267380 G>C,g.286723 T>G,g.288540 C>T,g.296721 T>C,g.310130 C>T,g.310196 C>T,g.312691 C>T,g.312757 C>T,g.329372 C>T。检测到的9个同义SNPs在巴马香猪和大型猪中均为不同的纯合基因型,且无杂合基因型出现（P<0.0001）。通过连锁不平衡与单倍型分析,这9个同义SNPs在巴马香猪和大型猪基因组中呈完全连锁不平衡（r2=1,D’=±1）,且9个同义SNPs在连锁不平衡影响下,共形成2种单倍型,巴马香猪形成了区别于大型猪的独特单倍型（巴马香猪单倍型:GTCTCCCCC,大型猪单倍型:CGTCTTTTT）。通过构建猪IGF1R胞内结构域（命名为My JKCF）5处同义突变构成的2种单倍型载体（巴马香猪单倍型CCCCC,大型猪单倍型TTTTT,且分别命名为pc DNA3.1（+）-My JKCF-BM,pc DNA3.1（+）-My JKCF-LP）,并瞬时转染PK-15猪肾细胞48 h后,pc DNA3.1（+）-My JKCF-LP载体表达的My JKCF-LP m RNA相对表达量显着高于pc DNA3.1（+）-My JKCF-BM载体中的相对表达量。在转染24h后,加入放线菌素D干扰RNA合成,与pc DNA3.1（+）-My JKCF-LP表达载体相比,pc DNA3.1（+）-My JKCF-BM表达的My JKCF-BM m RNA更为稳定。利用m RNA二级结构预测,IGF1R胞内结构域巴马香猪单倍型（CCCCC）的m RNA最小自由能为-497.30 kcal/mol,大型猪单倍型（TTTTT）m RNA的最小自由能为-495.20 kcal/mol,可见IGF1R胞内结构域巴马香猪单倍型m RNA的二级结构更为稳定;同时,IGF1R胞内结构域5处同义突变形成的2种单倍型的m RNA二级结构发生了变化。通过免疫印迹和灰度分析,2种表达载体瞬时转染PK-15猪肾细胞48 h后,pc DNA3.1（+）-My JKCF-LP载体表达的目的蛋白My JKCF-LP极显着高于pc DNA3.1（+）-My JKCF-BM载体表达的目的蛋白My JKCF-BM。通过密码子使用偏爱性预测,经Bland-Altman一致性检验和Fisher精确检验,对巴马香猪、大型猪中IGF1R基因编码区9处同义SNPs影响的共29个密码子的使用频率进行了统计和分析,结果表明不同使用频率的密码子在不同的猪种上有不同的偏爱性,低频率密码子,大型猪使用频率较高,高频率密码子,巴马香猪使用频率较高。以上结果表明,巴马香猪,大型猪（大白猪、长白猪、杜洛克）IGF-1R胞内结构域外显子上的SNPs可影响m RNA转录和蛋白质翻译。因此,这些SNPs对不同猪种中IGF1R的表达有调节作用。
郭玉平[7]（2013）在《陆地棉产量、纤维品质等性状与SSR标记的关联分析》文中提出作为世界上最重要的天然纤维作物，棉花为我国纺织产业的发展作出了重大贡献。当前，提高产量、改善纤维品质是棉花育种工作的重要目标。在充分了解陆地棉品种（系）的遗传多样性的基础上，筛选到与产量、纤维品质等性状相关联的标记位点，对拓宽棉花育种的遗传基础以及提高棉花育种效率具有重要意义。1.本研究利用均匀分布于26条染色体上的125对SSR标记对126份陆地棉品种（系）进行遗传多样性、群体结构和连锁不平衡（LD）分析；并进行了产量和纤维品质等性状与SSR标记的关联分析，发掘出一批优异的等位变异位点。获得主要结果如下：（1）遗传多样性分析检测到125个位点，共有423个等位变异，平均每个标记为3.38个，基因多样性含量（GDC）平均值为0.49，多态性信息含量（PIC）平均值为0.41，说明供试材料遗传多样性比较丰富。（2）使用Structure软件推算126份陆地棉材料结构，确定存在2个类群，且品种（系）的分类具有地域性。与采用Nei氏距离聚类的结果比较具有较高的一致性。（3）使用TASSEL软件进行连锁不平衡分析表明，D’>0.5的位点组合占11.95%，支持的不平衡成对位点（P <0.01）组合占7.13%。表明，陆地棉SSR标记位点间LD水平整体较低。但连锁不平衡矩阵图显示陆地棉染色体上LD分布不均匀，在A13、D1和D8染色体上LD水平较高。（4）通过关联分析，共检测出55个标记与14个性状呈极显着关联，其中与单株铃数、果枝数、株高、铃重、衣分、种仁蛋白含量、种仁脂肪含量、纤维长度、纤维比强度、马克隆值、短纤维含量、纤维整齐度、纤维伸长率及纤维反射率呈极显着相关联的分子标记分别有11、1、1、1、4、7、4、6、4、1、2、1、9和3个。研究结果为这些性状的分子标记辅助育种奠定了基础。（5）通过关联分析进行了优异等位变异的发掘，检测到大量标记位点与产量、品质等性状相关联，发掘出了一批关联优异位点、等位变异及携带优异等位变异的载体材料。为棉花育种中的亲本选拔、组合选配及后代等位变异辅助选择提供了重要参考信息。2.利用CodonW软件对棉花13个A、D基因组二倍体棉种和2个异源四倍体棉种的核基因组蛋白编码序列进行了同义密码子偏爱性分析，主要结果如下：（1）不同棉种的密码子碱基构成相似，而且使用T结尾的频率高于A，使用C结尾的频率高于G，即密码子第三位碱基上嘧啶出现频率高于嘌呤。RSCU值分析表明不同棉种在密码子选用上存在明显的偏爱性，并且这种偏爱性在不同棉种间存在较高的一致性；确定了在15个棉种中通用的20个高频密码子，并通过比较两个高低密码子偏性库RSCU值，确定出15个棉种的15个最优密码子（Preferred codon）（△RSCU≥0.3）。（2） ENC-plot分析表明密码子偏性用法主要由突变和选择共同作用所致，其中选择起主导作用。与前人研究比较发现，陆地棉核基因组与叶绿体基因组在涉及8种氨基酸的高频密码子上和最优密码子上存在较大差异。（3）15个棉种基于RSCU值的聚类分析结果与传统分类方法的结果有很好的一致性，表明密码子偏爱性在一定程度上反映了不同棉种的起源和进化关系。
常华[8]（2011）在《鸭瘟病毒gE基因功能初步研究》文中提出1.鸭瘟病毒gE基因的序列特征及密码子偏爱性的生物信息学分析本实验室注册的鸭瘟病毒（Duck plague virus, DPV） gE基因全长为1473bp （GenBank登录号为EU071044）。用生物信息学软件分析gE基因及该基因编码的蛋白,结果表明该基因编码490个氨基酸的多肽,含有信号肽切割位点,在整个多肽链中存在21个抗原决定簇、4个潜在的酰基化位点、29个磷酸化位点和6个N-糖基化位点；gE糖蛋白是典型的Ⅰ型膜蛋白,N端由396个氨基酸组成胞外区,中间为23个氨基酸组成跨膜区,C端为71个氨基酸组成胞内区；亚细胞定位分析表明gE糖蛋白主要位于细胞质；系统进化树分析显示DPV gE与α-疱疹病毒亚科中的马立克病毒属（Mardivirus）亲缘关系较近；同时分析了DPV gE基因密码子偏爱性,结果表明DPV gE基因在同义密码子中较偏爱第三位为A和T的密码子,如选择原核表达系统表达该蛋白则要选择宿主表达菌,才能利于DPV gE基因的体外表达。2.鸭瘟病毒gE基因的克隆、原核表达及其多克隆抗体的制备用Primer Premier5.0软件设计一对鸭瘟病毒（DPV）gE基因序列的特异性引物,采用PCR方法从鸭瘟病毒基因组DNA中扩增gE基因,将gE基因片段克隆至pMD18-T载体中,用双酶切（EcoR I和Xho I）方法和DNA测序鉴定正确后,命名为pMD18-T-gE。并采用酶切的方法将gE基因正向插入原核表达载体pET32a（+） （EcoR I和XhoI位点间）,成功构建了重组表达质粒pET32a-gE。将该重组表达质粒转化到表达宿主菌BL21（DE3）、BL21（pLysS）和Rosseta中,用IPTG诱导,经过对表达宿主菌、诱导温度、诱导时间的优化,确定了该重组表达质粒的最佳诱导条件为在表达宿主菌Rosseta中用0.2mmol/L IPTG,30℃条件下诱导4.5h,表达出了大小约为74KD的重组蛋白pET32a/DPV-gE,且主要以包涵体形式存在。将表达产物用包涵体洗涤方法纯化后,高纯度的表达蛋白与等量弗氏佐剂混合作为免疫原,经过四次免疫家兔,获得了兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE的多克隆抗体。血清用饱和硫酸铵法粗提IgG,并经High Q阴离子交换柱层析纯化后,得到了特异性强的兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE的抗体IgG。3.鸭瘟病毒gE蛋白在病毒感染宿主细胞中的定位本研究将纯化的兔抗重组蛋白pET32a/DPV gE IgG作为一抗,用间接免疫荧光技术检测DPV gE蛋白在病毒感染鸭胚成纤维细胞内的定位,结果显示早在感染DPV 5.5 h后,细胞质中检测到特异性荧光点,在感染后9-24h荧光强度增强,在感染36h时绿色荧光广泛分布在细胞浆中,之后随着细胞病变在48 h时胞浆中的绿色荧光开始减弱,且一些绿色荧光聚集且靠近核区域,60h细胞病变脱落形成空斑,此时绿色荧光减少且减弱。4.鸭瘟病毒gE基因在感染宿主细胞中的转录和表达特征本研究应用实时荧光定量PCR方法和Western blotting检测DPV感染鸭胚成纤维细胞后DPV gE基因的转录和表达情况。结果表明gE基因在DPV感染后4h时开始转录,8h检测到表达,在感染36h后转录和表达量最高,随后逐渐降低。且DPV gE基因在鸭胚成纤维细胞中表达产物的分子量约为54KD。5.利用间接免疫酶组化法（IPA）检测DPV gE蛋白在感染鸭组织中的分布规律本研究将30日龄鸭人工感染DPV强毒,在感染病毒后于不同的时间点采集不同的器官或组织,并制备切片,用兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE IgG作为一抗,用间接免疫酶组化法（IPA）检测DPV gE蛋白在感染鸭组织中的分布规律。在感染后6h DPV gE蛋白在免疫器官（胸腺、法氏囊、脾）中被检测到,在感染后8h-12h检测到DPV gE蛋白分布在哈德氏腺、食道、腺胃、肝和肠道,且随感染时间增加阳性信号也增强,在感染后24h-48h在肾、肺、心、脑也检测到DPV gE蛋白。6.用间接免疫荧光方法（IFA）检测DPV gE蛋白在感染鸭组织中的分布将30日龄鸭人工感染DPV强毒,在感染病毒后于不同的时间点采集不同的器官或组织,用兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE IgG作为一抗,经建立优化的间接免疫荧光（IFA）方法检测DPV gE蛋白在鸭体组织中的分布。结果显示感染鸭瘟病毒后DPV gE蛋白分布在免疫器官（脾脏、法氏囊、胸腺、哈德氏腺）、消化器官（肝脏、肠道、食管、腺胃）及实质器官（肾、心、脑及肺）。在感染后4h, DPV gE蛋白首先在脾脏和法氏囊中检测到,随后在感染后8h在哈氏腺、胸腺、肝脏和肠道也检测gE蛋白,在感染后12h在肾、心、肺和脑中也开始检测到弱阳性信号,且随感染时间从12h到216h阳性信号逐渐增多。7.基于重组蛋白pET32a/DPV-gE的间接ELISA法检测鸭瘟病毒抗体的建立及应用本研究基于纯化的重组蛋白pET32a/DPV-gE建立了间接ELISA方法检测DPV血清抗体。重组蛋白pET32a/DPV-gE最佳包被稀释度为1:100（2ug/100ul）,最佳酶标二抗的稀释度为1：1000,最佳血清稀释度为1：160。用建立的DPV-gE-ELISA方法检测鸭沙门氏菌（Salmonella anatum, S.anatum）、鸭大肠杆菌（E.coli）、鸭疫里默氏菌（RA）阳性血清和鸭病毒性肝炎病毒（DHV）,结果均显示阴性；批内或批间重复试验的变异系数均小于10%；可以检测出经1：1280倍稀释的DPV阳性血清。用DPV-gE-ELISA与本实验室已建立的包被DPV全病毒ELISA法（DPV-ELISA）对55份地方鸭血清进行检测,结果显示,与DPV-ELISA的符合率为87.27%。
刘菲[9]（2011）在《天府肉鹅α干扰素基因克隆、表达及其生物学活性研究》文中研究表明我国是水禽生产大国,天府肉鹅具有良好的遗传特性,在整个西南地区的占有率很高,养殖规模较大,社会和经济效益显着。随着集约化养鹅业的发展,研究开发出能有效增强鹅疫苗的免疫力和对鹅病毒具有抑制或杀灭作用的生物制剂,对鹅病的有效防治具有重要的意义。IFN-α干扰素具有良好的广谱抗病毒活性和有效的免疫调节功能。本研究采用基因工程及相关技术,借鉴相关研究,对天府肉鹅IFN-α（tf-GoIFNα）进行克隆、表达及其功能与应用研究。1天府肉鹅干扰素-α基因的克隆及生物信息学分析采用RT-PCR法从天府肉鹅外周血单核细胞中扩增出其IFN-α基因（tf-GoIFNα）;并将上述扩增片段克隆到pMD18-T载体中,构建重组质粒。用生物信息学软件及在线分析方法对tf-GoIFNα基因的核酸及氨基酸序列进行分析,同时分析13个与其相关的基因序列的相似性及进化情况。实验结果表明,tf-GoIFNα克隆成功,完整的ORF基因全长576个核苷酸,编码191个氨基酸,表达蛋白分子质量为21670.7Da,潜在的信号肽切割部位位于第28位的A（丙氨酸）和第29位的F（苯丙氨酸）氨基酸之间,二级结构主要由0-螺旋（H）和无规则卷曲组成,大致包括10个抗原表位；tf-GoIFNα基因编码的氨基酸序列含有2个潜在的N-糖基化位点,9个潜在的O-糖基化位点,含有5个潜在的磷酸化位点,第一个疏水区同信号肽位置一致,提示信号肽引导蛋白分泌到胞外作用,没有跨膜区,亚细胞定位预测,tf-GoIFNα表达的蛋白大约会有55.6%在细胞外,22.2%在细胞质,l 1.1%在线粒体,11.1%在细胞核；序列分析及比较结果显示tf-GoIFNα与同类的水禽（鸭、鹅）有90%之上的相似性,在进化树中位于同一分支。与狮头鹅的同源性最近,其中核酸相似性达到99.3%,氨基酸相似性达到97.9%；基因密码子特征分析表明,本研究所克隆的tf-GoIFNα为高表达、密码子偏性较高的基因,其密码子偏爱性情况与鸭IFN-α相近,与鸡IFN-α基因的密码子偏爱性有所不同,提示可以参照和借鉴已经开展的鸭IFN-α基因的表达,开展tf-GoIFN-α的表达及进一步的深入研究。2 tf-GoIFN-α成熟肽基因的原核表达及抗病毒活性检测参照已克隆的tf-GoIFNα完整ORF基因序列设计引物,克隆到了成熟肽基因,基因全长486bp。将成熟肽基因与原核表达载体pET32a连接,构建原核表达载体pET32-mtf-GoIFN-α,并于表达菌Rosetta中表达,成功表达大小为38kDa的蛋白。表达蛋白经过Ni-IMAC亲和层析纯化以及稀释透析复性后,SDS-PAGE显示蛋白己纯化为单一条带。采用微量细胞病变抑制法分析测定IFN的抗病毒活性,纯化复性的重组质粒pET32-mtf-GoIFN-α表达蛋白抗VSV活性为104U/mL,比活性为5.5×103U/mmg。并且在GEF和DEF中检测到鹅IFN-α重组蛋白抗VSV效果是一致的。SYBR Green real-time PCR检测,复性后的tf-GoIFNα重组蛋白进行抗GPV,IFN保护组以及GPV组病毒拷贝数之间存在显着性差异（P<0.05）,tf-GoIFNα重组蛋白具有抗GPV的活性作用,对GPV病毒的相对抑制率达89.4%。3鹅IgG的提取纯化及兔抗鹅IgG酶标抗体的制备为了研究兔抗鹅IgG酶标抗体的制备,试验采用水稀释-辛酸-硫酸铵法粗提,透析除盐,DEAE50纤维素层析相结合的方法提取鹅卵黄IgG,经核酸蛋白检测仪和SDS-PAGE测定IgG浓度,制备兔抗鹅IgG酶标抗体。结果表明：粗提的IgG浓度为10mg/mL,抗体纯度可达到94.5%；免疫扩散得出兔抗鹅IgG抗血清效价约1：32,抗体酶标后效价为1：3000,具有应用价值。4 tf-GoIFN-α真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的瞬时表达为了进一步研究tf-GoIFNα基因的特性和功能,将tf-GoIFNα基因克隆到pcDNA3.1-（+）真核表达载体上,构建重组质粒pcDNA3.1-GoIFN-α,脂质体介导将其转入COS-7细胞,应用间接免疫荧光、ELISA和Western-blot法检测GoIFN-α基因在COS-7细胞中的转录和表达情况,并对COS-7细胞表达上清液进行抗病毒活性检测。结果表明,真核表达载体pcDNA3.1-GoIFN-α构建成功,目的蛋白在转染12h后就可以被检测出,36h前目的蛋白在上清液中快速增加,之后增加速度变慢；重组质粒能够在COS-7细胞内得到高效表达,表达的蛋白分子量为38kDa,比预测的分子质量（约21kDaA）大；间接免疫荧光显示,tf-GoIFNα基因产物由细胞核向细胞浆发散；表达产物经细胞病变抑制法测定,显示出具有明显的抗猪水泡性口炎病毒（VSV）及小鹅瘟病毒（GPV）的活性。5tf-GoIFN-α真核表达质粒对GPV-VP3基因疫苗的免疫佐剂效应为检测tf-GoIFN-α真核表达质粒（pcDNA-GoIFN-α）对GPV-VP3基因疫苗的佐剂作用,将pcDNA-GoIFN-α以每只50、100、200μg三个剂量与GPV-VP3基因疫苗一起用肌肉注射法分别免疫28日龄鹅,同时设分子佐剂gIL2对照组、分子佐剂GoIFN-α与gIL2联合免疫佐剂组、空载体质粒pcDNA3.1（+）对照组、小鹅瘟弱毒对照组和空白对照组,接种后第3、7、14、21、28、35、49d采抗凝血用淋巴细胞增殖试验（MTT法）测定鹅外周血T淋巴细胞转化；第3、7、14、21、28、35、49、63、77 d采凝血用间接ELISA法以及中和试验检测血清抗体水平。结果显示：（]）淋巴细胞对ConA的反应能力（OD值）pcDNA-GoIFN-a以不同剂量与GPV-VP3基因疫苗一起免疫鹅后,各实验组的T淋巴细胞增殖反应在第3d基本维持同一水平,从第3d到第28d稳步上升,在28 d达到了最高峰,而pcDNA-VP3免疫组在第35d达到高峰。在第28d,佐剂组的OD值均极显着（P≤0.01）高于pcDNA-VP3基因疫苗组、GPV弱毒组、pcDNA3.1 （+）和生理盐水对照组。GoIFN-α佐剂组只在第21d显着（P<0.05）高于gIL2佐剂组,其他时间点差异不显着。联合佐剂组在第14d、第28d到第49d均显着高于GoIFN-α或gIL2佐剂组（P<0.05）。（2）外周血抗体IgG水平（OD值）佐剂免疫组的ELISA抗体水平从第3d的增长趋势为先慢后快,至第35d到达最大值,之后逐渐下降,但仍明显高于pcDNA-VP3基因疫苗组和GPV弱毒组。gIL2佐剂组在第28d到第42d和63d到第77d显着高于GoIFN-α佐剂免疫组（P≤0.05）,GoIFN-α和gIL2联合佐剂免疫组在第21d到第77d极显着高于GoIFN-α或gIL2单独佐剂免疫组（P≤0.01）。在GoIFN-α佐剂组中,佐剂作用呈一定的剂量相关性。（3）外周血中和抗体效价在免疫后第60d和第75d,GoIFN-α/gIL2联合佐剂组极显着（P≤0.01）高于GoIFN-α或gIL2佐剂组（表8-5）。佐剂组的中和抗体效价在第45d到第75d期间均显着（P≤0.05）或极显着（P<0.01）高于pcDNA-VP3组。GPV弱毒组在第45d显着高于GoIFN-α或gIL2单独佐剂组诱导的中和抗体水平（P≤0.05）,与GoIFN-α和gIL2联合佐剂组所诱导的中和抗体水平差异不显着。整个检测过程中,注射pcDNA3.1（+）和生理盐水的鹅对照血清不能保护细胞对抗病毒的感染。实验证明,pcDNA-GoIFN-α能使GPV-VP3基因疫苗诱导的T淋巴细胞转化能力增强,血清抗体IgG水平和中和抗体效价升高,是一种良好的增强GPVVP3基因疫苗的分子佐剂,分子佐剂goIFN-α和golL2联合免疫组效果最佳,pcDNA-goIFN-α肌肉注射200μg/只的效果次之。6 tf-GoIFNα在毕赤酵母中的分泌表达及其活性检测为了更好的利用基因工程技术来开发重组鹅IFN-α制剂,应用PCR技术从含有tf-GoIFNα完整ORF的重组质粒pMD18-T-GoIFN-α中扩增鹅α干扰素的成熟肽基因,亚克隆于穿梭载体pPICZαA上,构建重组酵母表达质粒pPICZαA-GoIFN-α;重组质粒经sacⅠ线性化后,电转化入酵母表达菌X33；1%的甲醇诱导表达3株不同的菌72小时后,斑点杂交筛选出高拷贝的转化子,Elisa法鉴定筛选最佳表达时间和甲醇浓度。重组子经诱导表达,TCA浓缩后,SDS-PAGE和Western-blot分析,并采用微量细胞病变抑制法分析研究其生物活性。结果表明,成功构建了重组鹅IFN-α的酵母表达质粒,并实现了其在毕赤酵母中的分泌表达；SDS-PAGE和Western-blot分析显示获得分子量约为22kDa的表达蛋白,比预测的蛋白分子量（18.7kDa）略大,估计是糖基化的原因；表达产物对水泡型口炎病毒在鹅胚成纤维细胞中可起抑制作用,抗病毒活性为1.79×103U/mL。
沈婵娟[10]（2010）在《鸭瘟病毒UL51基因部分特性及其基因工程蛋白应用的研究》文中研究指明1鸭瘟病毒U151基因的序列特征分析及密码子偏爱性分析根据本实验室构建的鸭瘟病毒（DPV） DNA文库,并结合NCBI中的开放阅读框（ORF） Finder和BLAST工具进行分析,一个完整的ORF被鉴定出来。该ORF是DPV UL51基因（GenBank No.DQ072725）,大小为759bp,编码一种皮层蛋白,并且含有一个在α-疱疹病毒亚科中保守的区域。进化关系分析揭示DPV UL51基因与马立克属疱疹病毒UL51基因的进化关系最近。之后,对该基因编码蛋白序列进行了一系列生物信息学分析,结果显示,该蛋白含有4个潜在的磷酸化位点、,1个潜在的酰基化位点和4个潜在的线性B细胞表位,表明它可能是一种磷酸化和酰基化的蛋白,并且能够诱导较强的免疫反应；同时,该蛋白不含任何的N-糖基化位点、跨膜区域、信号肽和核定位信号,却含有高尔基体定位信号,表明它可能定位于胞浆的高尔基体中。对DPV UL51基因密码子偏爱性分析的结果揭示,该基因对同义密码子中第三位为A和T的密码子有强烈的偏爱性,并且原核表达系统可能更适合该基因的表达。这些结果为进一步研究DPV UL51基因的特性和功能提供了理论支持。2 DPV UL51基因的克隆、原核表达、产物纯化及其多克隆抗体的制备根据本实验室提供的DPV UL51基因序列,采用primer5.0软件设计一对特异性引物,运用PCR方法从DPV基因组DNA中扩增UL51基因,并将其克隆至pMD18-T载体中,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切、PCR和DNA测序鉴定正确后,将该基因正向插入原核表达载体pET28a（+）的EcoRⅠ和XhoⅠ位点之间,成功构建了重组表达质粒pET28a-UL51。将该表达质粒转化到表达宿主菌BL21（DE3）中,用IPTG诱导,表达出了大小约为34KD的重组UL51蛋白,并且主要以包涵体形式存在；经过对诱导剂IPTG浓度、诱导温度和诱导时间的优化,确定了该重组表达质粒的最佳诱导条件为0.8mmol/L IPTG、37℃条件下诱导4h。将表达产物用镍柱梯度亲和层析纯化后,高纯度的表达蛋白与等量弗氏佐剂混合作为免疫原,四次免疫家兔,获得了抗重组UL51蛋白高免血清。将该血清经辛酸-硫酸铵粗提和High Q阴离子交换柱层析纯化后,得到了特异性强的兔抗重组UL51蛋白抗体IgG,为进一步研究DPV UL51基因的特性和功能奠定了基础。3 DPV UL51基因在感染宿主细胞中的转录和表达特征本试验应用实时荧光定量RT-PCR和Western blotting法检测DPV UL51基因在鸭胚成纤维细胞（DEF）中的转录和表达情况。结果表明：该基因在DPV感染后2h时已经开始转录,8h开始表达,48h转录和表达量都达到最高峰,之后逐渐降低；该基因在DEF细胞中的表达产物分子量为34KD；并且该基因表达产物是病毒粒子的一种组成成分。该研究为阐明DPVUL51基因的功能提供了有用的数据。4 DPV UL51蛋白在病毒感染细胞中的定位通过间接免疫荧光技术检测DPV UL51蛋白在病毒感染细胞内的定位特性,结果显示,最早可在感染后8h的胞浆中检测到特异性荧光点,24-36 h有大量绿色荧光团块聚集于近核区域,之后随着细胞病变的增强,胞核和胞浆中的绿色荧光均开始减弱。用胶体金免疫电镜法检测DPV UL51蛋白在DPV感染细胞中的亚细胞定位,结果显示,DPV UL51蛋白主要位于胞浆空泡中的病毒粒子和一些膜结构上；此外,在感染早期,DPV UL51蛋白大量累积于高尔基复合体膜上,其后通过某种未知机理被运送到细胞膜附近。该研究也为阐明DPVUL51蛋白的功能奠定了基础。5 DPV UL51基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时转录和表达特性根据DPV UL51基因序列设计一对特异性引物,用PCR扩增并克隆至pMD18-T载体上,经双酶切和测序鉴定后,再将该目的片段亚克隆到pcDNA3.1（+）真核表达载体上,得到重组质粒pcDNA3.1-UL51,通过脂质体介导将其转入COS-7细胞；应用实时荧光定量RT-PCR、Western blotting和间接免疫荧光法检测该基因在COS-7细胞中的转录、表达和定位情况。结果表明：该基因在转染后6h时已经开始转录,12 h开始表达,24 h转录和表达量都达到最高峰,之后逐渐降低；并且该基因在COS-7细胞中得表达产物的分子量为33 KD。间接免疫荧光法显示该基因的表达产物早期聚集于近核区域,晚期定位于胞浆和胞核中。该研究也为阐明DPV UL51基因的特性和功能提供了有用的数据。6用免疫组化方法检测DPV UL51蛋白在人工感染鸭组织中的定位和动态分布采用DPV强毒CHv株人工感染30日龄鸭,于攻毒后于不同时间采集法氏囊、胸腺、脾、哈德氏腺、肝、胰、食管、腺胃、小肠（包括十二指肠、空肠和回肠）、大肠（包括盲肠和直肠）、脑、肾、肺、心、肌肉组织或器官,用建立的基于重组UL51蛋白抗体的间接免疫荧光和免疫酶组化法,分别检测DPV UL51蛋白在鸭体组织中的定位和动态分布。结果表明,DPV UL51蛋白主要分布在法氏囊、胸腺、脾脏、肝脏、食道、和肠道中,并且主要定位于淋巴细胞、网状细胞、巨噬细胞和上皮细胞的胞浆中。本研究不仅有助于理解在急性DPV感染时,DPV的致病机理,同时也为α-疱疹病毒UL51蛋白同源物的定位和分布的研究奠定了基础。7基于重组UL51蛋白的间接EL ISA法和胶体金免疫层析试纸条法检测鸭瘟病毒抗体的研究和应用DPV感染给世界上养鸭国家和地区造成了重大的经济损失。DPV特异性抗体的监测是评价DPV弱毒疫苗效果和制定合理的免疫程序的关键。因此,本研究中,基于纯化的重组UL51蛋白,我们分别建立了一种间接ELISA法（UL51-ELISA）和一种免疫层析试纸条法（UL51-ICS）来检测DPV血清抗体。首先对UL51-ELISA法的反应条件进行优化,结果表明,最适重组UL51蛋白包被量为2.5μg/100μL,最佳的血清稀释倍数为1：200,最佳的酶标二抗稀释倍数为1：2000；用建立的UL51-ELISA法对鸭病毒性肝炎病毒（DHV）、鸭疫里默氏菌（RA）、鸭大肠杆菌（E.coli）的阳性血清进行检测,结果均为阴性,特异性好；对酶标板内或板间重复试验显示变异系数均小于10%,能检出经1：3200倍稀释的DPV阳性血清。UL51-ICS是基于膜层析原理,并以胶体金标记的重组UL51蛋白和胶体金标记的羊抗兔IgG混合物共同作为示踪剂的一种方法。该ICS法将纯化的重组UL51蛋白抗原包被于检测线（T）,兔IgG包被于质控线（C）。经优化和筛选,确定了UL51-ICS法中的重组UL51蛋白、兔IgG、胶体金标记的重组UL51蛋白和胶体金标记的羊抗兔IgG的最佳工作浓度分别为2mg/mL、lmg/mL、2mg/mL和2mg/mL。用建立的UL51-ICS法分别对非DPV的鸭源病原体阳性血清进行检测,结果均为阴性,特异性好；并能检出经1：128倍稀释的DPV阳性血清。同时,该法也具有良好的批内及批间重复性和较好的稳定性,制备好的试纸条至少可在4℃或25℃保存1年；为了评价UL51-ELISA和UL51-ICS法的效果,我们同时用UL51-ELISA、UL51-ICS、包被全病毒的ELISA法（DPV-ELISA）和中和试验（NT）四种方法对110份地方鸭血清进行检测,结果显示,与DPV-ELISA和NT相比,本研究建立的UL51-ELISA法与UL51-ICS法都有较高的特异性、敏感性和很高的的符合率,并且成本低,适于在现场或实验室进行DPV感染的血清学监测。8基于抗重组UL51蛋白抗体的抗原捕获ELISA法和胶体金免疫层析试纸条法检测DPV的研究和应用本研究中,我们使用纯化的大鼠抗重组UL51蛋白多克隆抗体和兔抗重组UL51蛋白多克隆抗体,分别建立了一种抗原捕获ELISA法（AC-ELISA）和一种胶体金免疫层析试纸条（ICS）法来检测DPV。使用建立的抗原捕获AC-ELISA方法,可以检测到1：640倍稀释的阳性DPV细胞培养液中的DPV；检测含DHV的鸭胚尿囊液、含RA的菌体培养液和含E. coli菌体培养液等结果均为阴性。使用建立的ICS法,可以检测到1：80倍稀释的阳性DPV细胞培养液中的DPV；检测含DHV的鸭胚尿囊液、含RA的菌体培养液和含E. coli菌体培养液,结果均为阴性。为了评价AC-ELISA和ICS方法的效果,我们同时用AC-ELISA、ICS和常规PCR三种方法对10份人工感染DPV强毒后的病鸭泄殖腔棉拭子样品进行检测,结果显示,与PCR方法相比,本研究建立的AC-ELISA法和ICS具有较高的特异性、敏感性和符合率,适于在现场或实验室进行DPV感染的检测。
二、基因及其表达调控中遗传密码选择的偏爱性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基因及其表达调控中遗传密码选择的偏爱性（论文提纲范文）
（1）IGF-1 c.258A>G同义突变小鼠模型的构建及其功能解析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 GH-IGF-1生长轴对机体生长发育调控及体型性状的研究现状 |
| 1.1 小型猪在生物医学领域的研究进展及应用前景 |
| 1.1.1 我国小型猪作为实验动物的优势与挑战 |
| 1.1.2 小型猪在生物医学领域的研究进展和应用前景 |
| 1.2 GH-IGF-1生长轴对机体生长发育调控机制的研究进展 |
| 1.2.1 GH-IGF-1生长轴的组成和生物学功能 |
| 1.2.2 GH-IGF-1生长轴对机体生长发育的调控作用 |
| 1.2.3 GH-IGF-1生长轴对动物衰老的调控作用 |
| 1.3 IGF-1基因及其多态性对动物体型性状影响潜在机制 |
| 1.3.1 IGF-1基因及其多态性影响动物体型性状的研究进展 |
| 1.3.2 IGF-1基因多态性对基因表达影响的研究进展 |
| 第2章 真核生物基因同义突变的研究进展 |
| 2.1 同义突变的生物学特性 |
| 2.1.1 同义密码子的使用偏爱性 |
| 2.1.2 同义突变的进化保守性 |
| 2.1.3 同义突变发生的位置 |
| 2.2 真核生物同义突变的生物学效应及调控机制 |
| 2.2.1 真核生物同义突变在DNA水平的调控机制 |
| 2.2.2 真核生物同义突变在mRNA水平的调控机制 |
| 2.2.3 真核生物同义突变对蛋白质生物合成的调控机制 |
| 2.3 真核生物同义突变的研究前景 |
| 第3章 单碱基编辑技术研究进展 |
| 3.1 基于CRISPR/Cas9的单碱基编辑器的原理 |
| 3.2 ABEs的发展史 |
| 3.3 ABEs的广泛应用 |
| 3.4 单碱基编辑技术的挑战与前景 |
| 第二篇 研究内容 |
| G同义突变小鼠模型的构建'>第1章 IGF-1 c.258A>G同义突变小鼠模型的构建 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 试剂配制方法 |
| 1.1.5 相关生物学软件 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 不同物种间IGF-1基因序列比对 |
| 1.2.2 IGF-1基因同义突变位点处密码子使用频率差异分析 |
| G位点的sgRNA设计'>1.2.3 基于小鼠IGF-1 c.258A>G位点的sgRNA设计 |
| 1.2.4 pUC57-Mus-IGF-1-sgRNA载体构建 |
| G同义突变pUC57-sgRNA载体的体外转录及纯化'>1.2.5 IGF-1 c.258A>G同义突变pUC57-sgRNA载体的体外转录及纯化 |
| 1.2.6 pCMV-ABEmax-Cas9质粒体外转录及纯化 |
| 1.2.7 小鼠受精卵胚胎注射 |
| 1.2.8 胚胎基因型分析 |
| 1.2.9 小鼠个体基因型分析 |
| 1.2.10 脱靶分析 |
| 1.2.11 小鼠的交配与繁殖 |
| 1.3 实验结果 |
| G同义突变发生的频率分布'>1.3.1 大型猪与小型猪IGF-1 c.258A>G同义突变发生的频率分布 |
| 1.3.2 不同物种间IGF-1 基因同源性比对及同义突变所在位点等位基因规律 |
| G同义突变所编码的丙氨酸密码子使用频率'>1.3.3 IGF-1 c.258A>G同义突变所编码的丙氨酸密码子使用频率 |
| G同义突变位点处设计sgRNAs'>1.3.4 在小鼠IGF-1c.258A>G同义突变位点处设计sgRNAs |
| 1.3.5 pUC57-sgRNA连接载体鉴定结果 |
| G同义突变单碱基编辑小鼠模型'>1.3.6 成功构建IGF-1 c.258A>G同义突变单碱基编辑小鼠模型 |
| G碱基编辑小鼠的脱靶鉴定'>1.3.7 IGF-1 c.258A>G碱基编辑小鼠的脱靶鉴定 |
| G碱基编辑小鼠的繁殖情况'>1.3.8 F2代IGF-1 c.258A>G碱基编辑小鼠的繁殖情况 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| G同义突变小鼠模型表型分析'>第2章 IGF-1 c.258A>G同义突变小鼠模型表型分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 试剂配制方法 |
| 2.1.5 相关生物学软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠体重、尾长及脏器指数测定 |
| 2.2.2 小鼠骨骼影像学分析 |
| 2.2.3 股骨组织形态学分析 |
| 2.2.4 组织RNA提取及cDNA合成 |
| 2.2.5 RT-qPCR检测不同基因型小鼠IGF-1基因mRNA水平的表达量 |
| 2.2.6 组织蛋白质的提取及蛋白质样品制备 |
| 2.2.7 Western Blot检测不同基因型小鼠组织中IGF-1蛋白质的表达量 |
| 2.2.8 不同基因型小鼠的血清学分析 |
| 2.2.9 数据分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 F2代不同基因型小鼠体重生长曲线 |
| 2.3.2 F2代不同基因型小鼠尾长及脏器指数 |
| 2.3.3 F2代不同基因型小鼠骨骼发育情况 |
| 2.3.4 F2代不同基因型小鼠IGF-1分泌量的血清学分析 |
| 2.3.5 F2代不同基因型小鼠对IGF-1 mRNA水平表达量的影响 |
| 2.3.6 F2代不同基因型小鼠中不同类型E肽表达比例的检测及潜在机制预测 |
| 2.3.7 F2代不同基因型小鼠对IGF-1蛋白质水平表达量的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| G同义突变影响基因表达的机制探索'>第3章 IGF-1 c.258A>G同义突变影响基因表达的机制探索 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞及表达载体 |
| 3.1.2 主要试剂盒及抗体 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.5 主要试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 携带不同Ala同义密码子的IGF-1表达载体构建 |
| 3.2.2 细胞培养及质粒转染 |
| 3.2.3 FLAG标签mRNA及蛋白质水平表达量检测 |
| 3.2.4 不同Ala同义密码子编码的IGF-1序列mRNA二级结构预测 |
| 3.2.5 不同Ala同义密码子编码的IGF-1 mRNA稳定性及蛋白质稳定性检测 |
| 3.2.6 不同Ala同义密码子编码的IGF-1的翻译起始效率检测 |
| 3.2.7 携带不同Ala同义密码子IGF-1的细胞增殖情况检测 |
| 3.2.8 数据统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 成功构建携带不同Ala同义密码子的IGF-1 表达载体 |
| 3.3.2 不同Ala同义密码子影响IGF-1 mRNA及蛋白质表达 |
| 3.3.3 不同Ala同义密码子影响IGF-1 mRNA及蛋白质稳定性 |
| 3.3.4 不同Ala同义密码子影响IGF-1 mRNA二级结构 |
| 3.3.5 不同Ala同义密码子影响IGF-1蛋白质翻译起始效率 |
| 3.3.6 不同Ala同义密码子影响IGF-1生物学功能 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）高致病性冠状病毒密码子偏爱性分析及S蛋白真核表达重组质粒的构建（论文提纲范文）
| 英文缩略词及中英文对照 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 一、冠状病毒结构及分类 |
| 二、冠状病毒感染细胞过程 |
| 三、冠状病毒S蛋白的结构及其功能 |
| 四、冠状病毒受体识别 |
| (一) 血管紧张素转化酶 2(ACE2) |
| (二) 二肽基肽酶(DPP4) |
| (三) 氨基肽酶(APN) |
| 五、密码子偏爱性分析 |
| (一) 衡量密码子偏好性指标 |
| (二) 密码子偏好性的影响因素 |
| (三) 密码子偏好性的分析方法 |
| 第二章 高致病性冠状病毒密码子偏爱性分析 |
| 第一节 六种人冠状病毒密码子偏爱性比较 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 有效密码子数目分析 |
| 3.2 相对密码子使用度 |
| 3.3 ENC-Plot关联分析 |
| 3.4 中性分析 |
| 3.5 奇偶规则分析 |
| 3.6 密码子偏爱性的聚类分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二节 SARS-CoV与SARSr-CoV密码子偏爱性比较及聚类分析 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 有效密码子数目分析 |
| 3.2 相对密码子使用度 |
| 3.3 ENC-Plot关联分析 |
| 3.4 中性分析 |
| 3.5 奇偶规则分析 |
| 3.6 基于密码子偏性的聚类分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三节 MERS-CoV密码子偏爱性分析及聚类分析 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 有效密码子数目分析 |
| 3.2 相对密码子使用度 |
| 3.3 ENC-Plot关联分析 |
| 3.4 中性分析 |
| 3.5 奇偶规则分析 |
| 3.6 基于密码子偏性的聚类分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 高致病性冠状病毒S蛋白的真核表达载体的构建 |
| 第一节 SARS-CoVS蛋白真核表达载体的构建 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二节MERS-CoVS蛋白真核表达载体的构建 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四章 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录A 六种冠状病毒同义密码子平均使用度(RSCU) |
| 附录B 真核表达重组质粒测序比对结果图 |
| 研究生期间发表的论文 |
| 致谢 |
（3）托桂型芍药花型形成的相关基因筛选及其调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 植物花器官发育的分子研究进展 |
| 2 RNA-seq转录组和iTRAQ蛋白质组学联合分析在植物分子研究中的应用 |
| 3 密码子使用偏好性在植物分子研究中的应用 |
| 4 DNA甲基化修饰在植物分子研究中的应用 |
| 5 本研究的目的及意义 |
| 第二章 芍药‘紫凤羽’内、外花瓣组织RNA-seq比较转录组分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 总RNA提取、文库建立及上机测序 |
| 1.3 转录组RNA-seq测序数据的生物信息学分析 |
| 1.3.1 原始数据过滤处理 |
| 1.3.2 Unigenes功能注释 |
| 1.3.3 Unigenes表达量计算 |
| 1.3.4 差异表达Unigenes筛选 |
| 1.3.5 差异表达Unigenes功能注释和pathway通路分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转录组测序数据质量评估 |
| 2.2 Unigenes的功能注释 |
| 2.3 差异表达基因筛选及功能富集分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 芍药‘紫凤羽’内、外花瓣组织iRAQ比较蛋白质组学分析及候选基因筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 蛋白提取和样品处理 |
| 1.3 酶解和除盐 |
| 1.4 iTRAQ标记和分组分 |
| 1.5 液相色谱-质谱联用分析和蛋白质鉴定 |
| 1.6 蛋白组学数据分析 |
| 1.6.1 数据质量控制 |
| 1.6.2 PCA主成分分析 |
| 1.6.3 PLS-DA图分析 |
| 1.6.4 HCA图分析 |
| 1.6.5 差异表达蛋白筛选 |
| 1.6.6 GO功能富集分析 |
| 1.6.7 KEGG-pathway通路富集分析 |
| 1.7 芍药花型调控的重要候选基因筛选 |
| 1.8 引物设计 |
| 1.9 Western blot验证 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 蛋白质组学质谱检测质量评估 |
| 2.2 蛋白质组学数据质量评估 |
| 2.3 差异表达蛋白筛选以及功能富集分析 |
| 2.4 基于转录组与蛋白组联合分析筛选芍药花型调控的重要候选基因 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 芍药花型调控候选基因PlAP2克隆及其表达特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 花瓣形态指标测定 |
| 1.4 花瓣解剖结构观察 |
| 1.5 引物设计 |
| 1.6 RNA提取、RACE克隆测序 |
| 1.6.1 组织总RNA提取 |
| 1.6.2 cDNA末端快速扩增(RACE) |
| 1.6.3 PCR扩增产物回收与鉴定 |
| 1.7 序列分析 |
| 1.7.1 编码序列确定及同源性分析 |
| 1.7.2 蛋白理化性质与基本结构预测 |
| 1.7.3 蛋白功能位点及保守功能域分析 |
| 1.7.4 亚细胞定位分析 |
| 1.8 定量表达分析 |
| 1.9 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 芍药花型调控关键基因PlAP2基因克隆及序列分析 |
| 2.2 蛋白结构与功能的生物信息学分析 |
| 2.2.1 基本理化性质 |
| 2.2.2 跨膜螺旋与疏水性 |
| 2.2.3 信号肽预测 |
| 2.2.4 糖基化和磷酸化位点 |
| 2.2.5 二级结构预测 |
| 2.2.6 保守功能域分析 |
| 2.2.7 亚细胞定位分析 |
| 2.3 芍药‘紫凤羽’品种内、外花瓣形态特征检测 |
| 2.4 芍药花型调控关键基因PlAP2基因表达特性分析 |
| 2.4.1 总RNA质量检测 |
| 2.4.2 扩增曲线与熔解曲线分析 |
| 2.4.3 PlAP2基因在芍药‘紫凤羽’不同发育时期内、外瓣间的组织表达差异分析 |
| 2.4.4 PlAP2基因在芍药托桂型不同品种内、外花瓣间的组织表达差异分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 芍药花型调控候选基因PlAP2启动子区甲基化修饰分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 引物设计 |
| 1.3 染色体步移 |
| 1.3.1 基因组DNA的获取 |
| 1.3.2 巢式PCR扩增 |
| 1.4 启动子区生物信息学分析 |
| 1.5 甲基化测序分析 |
| 1.5.1 原始测序读长 |
| 1.5.2 测序质量评估 |
| 1.5.3 参考序列比对分析 |
| 1.5.4 胞嘧啶甲基化水平分析 |
| 1.6 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 芍药PlAP2基因5'上游启动子区克隆及序列分析 |
| 2.2 芍药不同发育时期花瓣PlAP2基因启动子CpG岛区域甲基化分析 |
| 2.3 芍药PlAP2基因甲基化水平与mRNA表达相关性分析 |
| 2.4 芍药PlAP2基因重要转录因子结合位点筛选 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第六章 芍药转录组及AP2基因密码子使用模式分析 |
| 第一节 基于RNA-seq的芍药转录组密码子使用模式分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 芍药转录组序列数据来源 |
| 1.2 碱基组成分析及中性绘图 |
| 1.3 同义密码子使用偏好性分析 |
| 1.4 ENC绘图分析 |
| 1.5 对应性分析 |
| 1.6 PR2绘图分析 |
| 1.7 最优密码子测定 |
| 1.8 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 GC含量分布以及中性绘图 |
| 2.2 ENC与GC3s的关联分析 |
| 2.3 PR2-plot分析 |
| 2.4 对应性分析COA |
| 2.5 突变压力和选择作用对芍药转录组密码子使用模式的影响 |
| 2.6 最优密码子(Optimal codons)分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本节小结 |
| 第二节 芍药等8个物种AP2基因密码子使用模式分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 序列数据来源 |
| 1.2 碱基组成与密码子偏好性分析 |
| 1.2.1 碱基组成 |
| 1.2.2 同义密码子相对使用度RSCU |
| 1.2.3 有效密码子数ENC |
| 1.2.4 最优密码子频率Fop |
| 1.2.5 ENC绘图分析(ENC-plot) |
| 1.3 基因表达评估分析 |
| 1.4 基于密码子使用偏性的聚类分析 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同植物AP2的密码子与GC偏好性(GC3s)的关系 |
| 2.2 不同植物AP2基因的密码子碱基组成和最优密码子测定 |
| 2.3 不同植物AP2基因的相对同义密码子使用度 |
| 2.4 基于密码子使用模式探讨不同植物AP2基因间进化关系 |
| 2.5 不同植物AP2基因选择压力的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 本节小结 |
| 全文结论 |
| 本研究创新点 |
| 本研究下一步工作计划 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（4）解脂耶氏酵母促进菌丝形成转录因子Mhy1的启动子、靶基因及结合位点的鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 研究背景 |
| 1.真菌的二型性转换 |
| 1.1 真菌的二型性的概念 |
| 1.2 真菌的二型性的意义 |
| 1.3 酿酒酵母的二型性转换 |
| 1.4 白色念珠菌的二型性转换 |
| 1.5 解脂耶氏酵母的二型性转换 |
| 2.Msn2及Msn4家族蛋白的功能、调控基因及结合位点 |
| 2.1 锌指蛋白简介 |
| 2.2 Msn2/4家族蛋白简介 |
| 2.3 酿酒酵母中的Msn2/4家族蛋白 |
| 2.4 Mnl1与CaMsn4:白色念珠菌Msn2/4家族蛋白 |
| 2.5 Mhy1:解脂耶氏酵母中Msn2/4同源蛋白 |
| 3.本课题的研究目的、内容和意义 |
| 3.1 研究目的 |
| 3.2 研究内容 |
| 3.3 研究意义 |
| 第二章 Mhy1及YlMsn4细胞学功能研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 本章实验所用菌株、质粒和引物 |
| 1.2 药品与试剂 |
| 1.3 培养基和溶液的制备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 解脂耶氏酵母的基因组提取 |
| 2.2 解脂耶氏酵母的快速转化 |
| 2.3 解脂耶氏酵母的基因敲除 |
| 2.4 基因缺失突变体的回补 |
| 2.5 解脂耶氏酵母基因的过量表达 |
| 2.6 解脂耶氏酵母的细胞培养及形态观察 |
| 2.7 解脂耶氏酵母的侵入性生长鉴定 |
| 2.8 β-半乳糖苷酶活性测定 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 Mhy1和YlMsn4的鉴定 |
| 3.2 MHY1和YlMSN4基因的敲除 |
| 3.3 mhy1?和Ylmsn4?突变体菌丝形成能力的鉴定 |
| 3.4 过量表达MHY1和YlMSN4菌株的形态鉴定 |
| 3.5 MHY1和YlMSN4缺失株与过量表达菌株的侵入性生长能力测定 |
| 3.6 MHY1和YlMSN4缺失株与过量表达菌株的耐受胁迫能力鉴定 |
| 3.7 mhy1?等突变体的脂肪酶、蛋白酶分泌能力鉴定 |
| 4.讨论 |
| 4.1 解脂耶氏酵母中存在两个Msn2/4家族锌指转录因子 |
| 4.2 解脂耶氏酵母Mhy1和YlMsn4与其它Msn2/4家族成员功能的异同 |
| 4.3 Mhy1对脂肪酶和蛋白酶的分泌有抑制作用 |
| 5.小结 |
| 第三章 MHY1启动子长度鉴定及调控元件研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 本部分实验所用菌株、质粒和引物 |
| 1.2 药品与试剂 |
| 1.3 培养基和溶液的制备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 GST融合蛋白的诱导表达 |
| 2.2 GST融合蛋白的表达检测 |
| 2.3 GST融合蛋白纯化 |
| 2.4 EMSA凝胶阻滞实验 |
| 2.5 基因的定点突变及部分截短 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 MHY1启动子区的长度鉴定 |
| 3.2 MHY1启动子中增强子的位置及长度鉴定 |
| 3.3 MHY1启动子-2895 bp至-2574 bp区段增强子鉴定 |
| 3.4 Mhy1调控自身转录的机制 |
| 4.讨论 |
| 4.1 MHY1基因的表达可能受到复杂的调控 |
| 4.2 MHY1基因的转录受其表达产物Mhy1的正调控 |
| 5.小结 |
| 第四章 Mhy1调控基因及结合靶位点研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 本章实验所用菌株、质粒和引物 |
| 1.2 药品与试剂 |
| 1.3 培养基和溶液的制备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 解脂耶氏酵母RNA的提取 |
| 2.2 RNA-Seq流程及数据分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 转录组测序的条件控制 |
| 3.2 转录组测序数据质量控制与比对情况 |
| 3.3 RNA-Seq差异基因统计分析 |
| 3.4 RNA-Seq数据的实验验证 |
| 3.5 RNA-Seq差异基因的类别 |
| 3.6 Mhy1调控靶基因的鉴定 |
| 3.7 Mhy1结合位点的研究 |
| 3.8 RNA-Seq中表达量发生变化的外分泌脂肪酶及蛋白酶 |
| 4.讨论 |
| 4.1 Mhy1的细胞学功能与调控的靶基因 |
| 4.2 Mhy1结合的DNA序列 |
| 5.小结 |
| 研究总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附件:转录组测序数据 |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（5）温度影响苎麻纤维品质转录组解析及特异型启动子鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 苎麻 |
| 1.2 苎麻纤维品质形成研究进展 |
| 1.2.1 苎麻纤维成分 |
| 1.2.2 环境因素对苎麻纤维品质的影响 |
| 1.2.3 苎麻品质形成相关基因研究 |
| 1.3 高通量测序技术在苎麻中的应用 |
| 1.4 韧皮部与韧皮部蛋白 |
| 1.4.1 植物韧皮部 |
| 1.4.2 韧皮部蛋白 |
| 1.5 启动子研究进展 |
| 1.5.1 启动子概况 |
| 1.5.2 诱导型启动子和组织特异型启动子及应用 |
| 1.5.3 启动子克隆策略及机理解析 |
| 1.5.4 组织特异型启动子筛选策略 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 两种温度模式下苎麻茎皮转录组研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 植物材料及生长条件 |
| 2.2.2 表型测定 |
| 2.2.3 样品制备、文库构建及测序 |
| 2.2.4 测序数据处理 |
| 2.2.5 基因表达水平分析、功能注释及差异表达分析 |
| 2.2.6 qRT-PCR分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 两种温度模式下苎麻表型差异 |
| 2.3.2 联合转录组测序 |
| 2.3.3 差异表达分析 |
| 2.3.3.1 差异表达基因聚类 |
| 2.3.3.2 组间差异表达基因分析 |
| 2.3.3.3 组间差异表达基因GO富集 |
| 2.3.4 温度影响细胞大小与果胶降解代谢 |
| 2.3.5 温度影响纤维素合成 |
| 2.3.6 温度影响半纤维素合成 |
| 2.3.7 温度影响木质素合成 |
| 2.3.8 qRT-PCR验证转录组数据 |
| 2.4 讨论与结论 |
| 2.4.1 全长转录组测序评估与应用 |
| 2.4.2 HTP/LTP影响纤维细度 |
| 2.4.3 HTP/LTP影响纤维素生物合成 |
| 2.4.4 HTP/LTP影响果胶和半纤维生物合成 |
| 2.4.5 HTP/LTP影响木质素生物合成 |
| 2.4.6 结论 |
| 3 韧皮部蛋白2(BnPP2)基因鉴定与表达分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 基于转录组数据库鉴定BnPP2 基因 |
| 3.2.2 BnPP2 基因克隆与结构分析 |
| 3.2.3 保守结构域鉴定与聚类分析 |
| 3.2.4 BnPP2-15 基因启动子克隆与GUS活性检测 |
| 3.2.5 植物材料、生长条件与处理 |
| 3.2.6 RNA提取与实时定量PCR(qRT-PCR)分析 |
| 3.2.7 表达载体构建与拟南芥遗传转化 |
| 3.2.8 烟草亚细胞定位与苎麻茎秆横切组织原位杂交 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 鉴定BnPP2 基因 |
| 3.3.2 BnPP2 基因结构与聚类分析以及保守结构域鉴定 |
| 3.3.3 BnPP2 在不同组织或器官中的表达模式 |
| 3.3.4 BnPP2 在生物和非生物胁迫下的表达模式 |
| 3.3.5 BnPP2-15 基因启动子在转基因拟南芥中的功能分析 |
| 3.3.6 亚细胞定位与原位杂交 |
| 3.4 讨论与结论 |
| 3.4.1 PP2 基因家族与PP2 蛋白结构域 |
| 3.4.2 BnPP2 基因表达偏爱性 |
| 3.4.3 逆境胁迫影响BnPP2 基因表达 |
| 3.4.4 BnPP2-15 基因启动子功能分析与差异 |
| 3.4.5 结论 |
| 4 苎麻特异型启动子鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 基因筛选、DNA提取、外显子~内含子结构及聚类分析 |
| 4.2.2 RNA提取、c DNA合成及qRT-PCR |
| 4.2.3 启动子分离与分析 |
| 4.2.4 构建启动子融合GUS表达载体及拟南芥转化 |
| 4.2.5 GUS组织化学染色与处理及GUS荧光测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 候选基因克隆与表达分析 |
| 4.3.2 启动子克隆与顺式作用元件预测 |
| 4.3.3 转基因拟南芥中GUS染色分析 |
| 4.3.4 GUS表达在根中特殊性与机械损伤诱导GUS表达 |
| 4.3.5 不同处理下转基因拟南芥GUS活性定量分析 |
| 4.4 讨论与结论 |
| 4.4.1 启动子应用与克隆 |
| 4.4.2 BnGDS与 BnSTM |
| 4.4.3 BnSUS1与BnSUT |
| 4.4.4 结论 |
| 5 展望 |
| 5.1 温度影响苎麻纤维品质形成的转录调控网络构建 |
| 5.2 BnPP2 基因功能验证 |
| 5.3 组织特异性启动子在苎麻遗传改良中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ qRT-PCR验证RNA-seq数据可靠性所挑选基因信息及引物 |
| 附录 Ⅱ 启动子元件预测结果 |
| 附录 Ⅲ 攻读博士学位期间发表文章 |
| 致谢 |
（6）猪IGF1R外显子SNPs筛查及IGF1R胞内结构域SNPs对其表达水平的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）的研究进展 |
| 1.1 猪IGF1R基因、蛋白结构概述 |
| 1.2 IGF1R基因多态性与人矮身材、动物矮小品种的研究进展 |
| 第二章 单核苷酸多态性（SNPs）的研究进展 |
| 2.1 单核苷酸多态性（SNPs） |
| 2.2 单核苷酸多态性（SNP）的连锁不平衡与单体型分析 |
| 第三章 同义单核苷酸多态性的研究进展 |
| 3.1 同义单核苷酸多态性 |
| 3.2 同义单核苷酸多态性与密码子使用偏爱性 |
| 3.3 同义单核苷酸多态性对转录和翻译的影响 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 不同猪种IGF1R外显子SNPs筛查及连锁不平衡分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 猪IGF1R胞内结构域不同单倍型mRNA表达量及稳定性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 猪IGF1R胞内结构域不同单倍型蛋白表达量检测及密码子使用频率预测分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（7）陆地棉产量、纤维品质等性状与SSR标记的关联分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 关联分析 |
| 1.1.1 连锁不平衡及关联分析的概念 |
| 1.1.2 连锁不平衡的计算 |
| 1.1.3 关联分析的优势 |
| 1.1.4 关联分析的策略及统计方法 |
| 1.1.5 关联分析的影响因素 |
| 1.1.6 关联分析在植物上的应用 |
| 1.1.7 关联分析在棉花上的应用 |
| 1.2 密码子偏爱性 |
| 1.2.3 密码子的使用模式 |
| 1.2.4 研究密码子偏爱性的价值 |
| 1.2.5 导致同义密码子偏爱性使用的原因 |
| 1.2.6 衡量同义密码子使用偏爱性的指标 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料 |
| 2.2 田间种植 |
| 2.3 数据的调查 |
| 2.3.1 产量及农艺相关性状的考察 |
| 2.3.2 纤维品质的测定 |
| 2.3.3 种子脂肪和蛋白含量的测定 |
| 2.4 DNA 的提取 |
| 2.5 SSR 扩增及扩增产物检测 |
| 2.5.1 SSR 引物的选用 |
| 2.5.2 SSR 反应体系及扩增程序 |
| 2.5.3 电泳 |
| 2.5.4 洗胶 |
| 2.6 数据统计及分析 |
| 2.6.1 关联分析分子标记数据的统计与分析方法 |
| 2.6.2 密码子偏爱性数据的统计及分析方法 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 关联分析 |
| 3.1.1 产量、纤维品质等性状的表型数据分析 |
| 3.1.2 产量、品质等性状的相关分析 |
| 3.1.3 遗传多样性及聚类分析 |
| 3.1.4 群体结构分析 |
| 3.1.5 连锁不平衡分析 |
| 3.1.6 性状和标记的关联分析 |
| 3.1.7 优异等位变异的发掘 |
| 3.2 15 个棉种密码子的偏爱性分析 |
| 3.2.1 棉种密码子碱基组成及 PR2-plot 分析 |
| 3.2.2 ENC 与 GC3s 描绘散点图(ENC-plot)分析 |
| 3.2.3 蛋白编码基因密码子 RSCU 值及最优密码子分析 |
| 3.2.4 基于密码子 RSCU 值的聚类分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 群体结构与关联分析 |
| 4.2 陆地棉中 SSR 位点间的连锁不平衡 |
| 4.3 陆地棉表型性状与分子标记的关联分析 |
| 4.4 优异关联位点及优异等位变异 |
| 4.5 15 棉种 A、D 基因组密码子偏爱性讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（8）鸭瘟病毒gE基因功能初步研究（论文提纲范文）
| 本论文的创新性工作 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 常用英文缩写词汇 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 疱疹病毒gE基因及其编码蛋白的研究进展 |
| 1. 疱疹病毒gE基因的特点 |
| 1.1 疱疹病毒gE基因序列特点 |
| 1.2 疱疹病毒gE基因的类型 |
| 2. 疱疹病毒gE基因编码蛋白的结构及功能 |
| 2.1 疱疹病毒gE基因编码蛋白的结构特点 |
| 2.2 疱疹病毒gE基因编码蛋白的功能 |
| 2.2.1 糖蛋白gE胞外区的功能 |
| 2.2.2 糖蛋白gE细胞质区的功能 |
| 3 疱疹病毒gE蛋白与其他蛋白的相互作用 |
| 3.1 gE蛋白与gI蛋白的相互作用 |
| 3.2 gE蛋白与VP22、gM、gD蛋白的相互作用 |
| 3.3 gE蛋白与US9蛋白 |
| 4 选题目的和意义 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第二章 DPV gE基因序列特征及其密码子偏爱性的生物信息学分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 基因文库 |
| 1.1.2 主要生物信息学分析软件 |
| 1.1.3 试验数据 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 DPV gE基因生物信息学分析的方法 |
| 1.2.2 DPV gE基因的密码子偏爱性分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 DPV gE基因的序列特征 |
| 2.2 DPV gE基因编码蛋白的序列特征 |
| 2.3 DPV gE基因编码蛋白的功能预测 |
| 2.3.1 跨膜区的预测结果 |
| 2.3.2 信号肽预测结果 |
| 2.3.3 亚细胞定位分析结果 |
| 2.3.4 DPV gE蛋白翻译后修饰的预测结果 |
| 2.3.5 DPV gE蛋白疏水性分析及抗原性分析 |
| 2.3.6 DPV gE蛋白的二级结构与三级结构的预测 |
| 2.4 DPV gE蛋白的系统进化树分析 |
| 2.5 DPV gE基因的密码子偏爱性分析 |
| 2.5.1 DPV gE基因与17种疱疹病毒gE基因间的密码子偏爱性分析 |
| 2.5.2 DPV gE基因的密码子使用频率和氨基酸组成偏爱分析 |
| 2.5.3 DPV gE基因稀有密码子的分析 |
| 2.5.4 DPV gE基因与大肠杆菌、酵母及人的密码子使用偏爱性比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DPV gE蛋白序列的分子特性分析 |
| 3.2 DPV gE蛋白的抗原性和高级结构特点 |
| 3.3 DPV gE蛋白与其它α-疱疹病毒gE蛋白的系统进化关系 |
| 3.4 DPVgE基因的密码子偏爱性分析及其对表达的影响 |
| 4 小结 |
| Abstract |
| 第三章 gE基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备 |
| 1. 试验材料 |
| 1.1 毒株与菌株 |
| 1.2 工具酶及主要试剂盒 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.3.1 核酸电泳试剂 |
| 1.3.2 SDS-PAGE凝胶电泳试剂 |
| 1.3.3 表达产物纯化试剂配制 |
| 1.3.4 Western blotting试剂 |
| 1.4 其他试剂配制 |
| 1.5 主要实验设备 |
| 2. 试验方法 |
| 2.1 构建DPV gE基因的克隆载体pMD18-T-gE |
| 2.1.1 鸭瘟病毒(DPV)基因组DNA的提取 |
| 2.1.2 PCR扩增鸭瘟病毒(DPV)gE基因 |
| 2.1.3 DPV gE基因的T-载体克隆与鉴定 |
| 2.2 构建DPV gE基因的原核表达载体 |
| 2.2.1 表达质粒pET-32a(+)与重组质粒pMD18-T-gE的提取、酶切及回收 |
| 2.2.2 重组表达菌株的构建 |
| 2.3 重组蛋白的诱导表达及条件优化 |
| 2.3.1 制备感受态细胞BL21、Rosetta和pLysS |
| 2.3.2 重组表达质粒转化至感受态细胞BL21、Rosetta和pLysS |
| 2.3.3 重组表达菌株的培养及表达 |
| 2.3.4 重组蛋白表达条件的优化 |
| 2.4 纯化重组蛋白 |
| 2.4.1 重组表达蛋白的可溶性分析 |
| 2.4.2 重组表达蛋白的大量制备 |
| 2.4.3 Western Blotting检测 |
| 2.5 兔抗重组表达蛋白高免血清的制备与纯化 |
| 2.5.1 兔抗重组蛋白高免血清的制备 |
| 2.5.2 兔抗重组蛋白高免血清IgG的纯化及鉴定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 DPV gE基因的扩增、T-克隆与鉴定 |
| 3.2 原核表达载体pET32a-gE的构建与鉴定 |
| 3.3 重组蛋白pET32a/DPV-gE的诱导表达 |
| 3.3.1 诱导表达重组蛋白pET32a/DPV-gE |
| 3.3.2 诱导重组蛋白pET32a/DPV-gE表达的条件优化 |
| 3.4 重组蛋白pET32a/DPV-gE的纯化 |
| 3.4.1 重组蛋白的可溶性分析 |
| 3.4.2 重组蛋白的大量纯化 |
| 3.5 兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE高免血清的制备 |
| 3.5.1 兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE高免血清效价测定 |
| 3.5.2 兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE高免血清IgG的纯化 |
| 3.6 Western Blotting检测 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 DPV gE基因的引物设计和克隆测序 |
| 4.2 DPV gE表达载体的选择 |
| 4.3 诱导表达条件的优化 |
| 4.4 包涵体的形成 |
| 4.5 疱疹病毒gE基因的表达 |
| 4.6 兔抗重组蛋白pET32a/DPV gE抗体的制备和纯化 |
| 5. 小结 |
| Abstract |
| 第四章 鸭瘟病毒gE蛋白在病毒感染宿主细胞中定位 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 主要试剂及仪器设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 检测DPV gE蛋白在感染宿主细胞中的定位 |
| 2.2 间接免疫荧光方法的条件优化 |
| 2.3 特异性检测 |
| 2.4 结果判定标准 |
| 2.5 DPV gE蛋白在感染宿主细胞中的动态监测 |
| 3 结果 |
| 3.1 间接免疫荧光检测DPV gE蛋白的细胞内定位方法的建立及优化 |
| 3.2 特异性试验 |
| 3.3 间接免疫荧光法检测DPVgE蛋白在DPV感染细胞中定位的动态 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于特定蛋白在细胞定位的研究方法 |
| 4.2 间接免疫荧光方法检测细胞定位的条件优化 |
| 4.3 DPV gE基因表达产物在宿主细胞定位的分析 |
| 4.4 疱疹病毒gE蛋白的亚细胞定位与其功能的关系 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第五章 DPV gE基因在宿主细胞的转录和表达特征 |
| 1. 材料 |
| 1.1 毒株、菌株、细胞及抗体 |
| 1.2 主要试剂及其配制 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2. 试验方法 |
| 2.1 荧光定量PCR方法检测DPV gE基因在感染宿主细胞中的转录时相 |
| 2.1.1 荧光定量PCR引物设计与合成 |
| 2.1.2 荧光定量PCR标准曲线的制作 |
| 2.2 Western blotting检测DPV gE基因在感染宿主细胞中的表达时相 |
| 2.2.1 DPV gE基因在感染宿主细胞中的表达 |
| 2.2.2 DPV gE基因在感染宿主细胞中的表达特征 |
| 3. 结果 |
| 3.1 DPV gE基因在宿主细胞中的转录特征 |
| 3.1.1 RNA完整性及纯度分析 |
| 3.1.2 引物特异性分析 |
| 3.1.3 β-actin内参基因的T-克隆与鉴定 |
| 3.1.4 标准曲线的制作 |
| 3.1.5 DPV gE基因在宿主细胞中的转录分析 |
| 3.2 DPV gE基因在宿主细胞中的表达特征 |
| 3.2.1 兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE IgG特异性分析 |
| 3.2.2 DPV gE基因在宿主细胞中的表达时相分析 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 运用实时荧光定量PCR方法检测DPV gE基因在感染宿主细胞中的转录时相 |
| 4.2 分析DPV gE基因转录特征 |
| 4.3 Western blotting方法检测DPV gE基因在宿主细胞中的表达时相分析 |
| 5. 小结 |
| Abstract |
| 第六章 利用间接免疫酶组化法(IPA)检测DPV gE蛋白在感染鸭组织中的分布规律 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株及抗体 |
| 1.2 试验动物及其他组织材料 |
| 1.3 试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 组织样品的制备 |
| 2.1.1 试验动物分组及采集样品 |
| 2.1.2 固定、包埋样品和制备切片 |
| 2.2 建立并优化间接免疫酶组化方法检测DPV gE蛋白在感染鸭组织的分布 |
| 2.2.1 间接免疫酶组化法检测在感染鸭组织中DPV gE蛋白的分布 |
| 2.2.2 检测DPV gE蛋白组织定位的间接免疫酶组化法的条件优化 |
| 2.2.3 特异性试验 |
| 2.2.4 结果判定标准 |
| 2.2.5 DPV gE蛋白在人工感染鸭组织中的定位和动态监测 |
| 3 结果 |
| 3.1 间接免疫酶组化检测DPV gE蛋白组织定位方法的最佳优化条件 |
| 3.2 特异性试验 |
| 3.3 DPV gE蛋白在感染鸭组织中的定位和动态分布 |
| 3.3.1 淋巴器官 |
| 3.3.2 消化器官 |
| 3.3.3 其它器官 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 免疫酶组化检测DPV gE蛋白的定位方法的建立与优化 |
| 4.2 间接免疫酶组化法检测DPVgE蛋白在感染鸭组织中的定位与分布 |
| 5. 小结 |
| Abstract |
| 第七章 用间接免疫荧光方法(IFA)检测DPV gE蛋白在感染鸭组织中的分布 |
| 1 材料 |
| 1.1 抗体、毒株及试验动物 |
| 1.2 试剂及配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 玻片处理及样品制备 |
| 2.2 切片 |
| 2.3 建立与优化基于pET32a/DPV-gE IgG介导的间接免疫荧光方法检测DPV gE蛋白在感染鸭组织的定位 |
| 2.4 利用IFA检测DPV gE蛋白在感染鸭组织中的分布 |
| 3 结果 |
| 3.1 间接免疫荧光检测DPV gE蛋白组织定位方法的优化结果 |
| 3.2 特异性试验结果 |
| 3.3 应用间接免疫荧光检测DPV gE在感染鸭组织中的定位及动态分布 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 间接免疫荧光法检测DPV gE蛋白的定位方法的建立与优化 |
| 4.2 间接免疫荧光法检测在感染鸭组织中DPV gE蛋白的分布 |
| 4.3 间接免疫荧光方法与免疫酶组化方法检测DPV gE蛋白在人工感染鸭体内的定位及分布规律比较 |
| 5. 小结 |
| Abstract |
| 第八章 基于重组蛋白pET32a/DPV-gE的间接ELISA法检测鸭瘟病毒抗体的建立及应用 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株及血清 |
| 1.2 主要试剂及配制 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组蛋白pET32a/DPV-gE的大量制备和纯化 |
| 2.2 pET 32a/DPV-gE-ELISA法检测DPV抗体方法的建立 |
| 2.2.1 pET 32a/DPV-gE-ELISA方法的检测程序 |
| 2.2.2 优化最佳的酶标二抗稀释度 |
| 2.2.3 优化最佳的包被抗原浓度及血清稀释度 |
| 2.2.4 pET 32a/DPV-gE-ELISA方法临界值的确定 |
| 2.2.5 特异性试验 |
| 2.2.6 敏感性试验 |
| 2.2.7 重复性试验 |
| 2.3 pET 32a/DPV-gE-ELISA法检测DPV抗体的应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组蛋白pET 32a/DPV-gE纯化的检测结果 |
| 3.2 pET 32a/DPV-gE-ELISA方法的建立 |
| 3.2.1 最佳酶标二抗稀释度的检测结果 |
| 3.2.2 最佳的包被抗原浓度及待检血清稀释度 |
| 3.2.3 ELISA阴阳性临界值的判定标准 |
| 3.2.4 特异性试验的检测结果 |
| 3.2.5 敏感性试验的检测结果 |
| 3.2.6 重复性试验的检测结果 |
| 3.3 地方血清样品检测结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 包被抗原的选择 |
| 4.2 基于重组蛋白pET 32a/DPV-gE建立间接ELISA方法检测DPV抗体的优化 |
| 5. 小结 |
| Abstract |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）天府肉鹅α干扰素基因克隆、表达及其生物学活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要(ABSTRACT) |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 干扰素的分类及性质 |
| 1.1 Ⅰ型干扰素 |
| 1.2 Ⅱ型干扰素 |
| 1.3 Ⅲ型干扰素 |
| 2 干扰素的分子结构 |
| 3 干扰素的产生 |
| 4 干扰素的作用机制 |
| 4.1 干扰素受体 |
| 4.1.1 Ⅰ型干扰素受体 |
| 4.1.2 Ⅱ型干扰素受体 |
| 4.1.3 IFN-γ受体 |
| 4.2 干扰素的信号传导和效应途径 |
| 4.2.1 干扰素的信号传导 |
| 4.2.1.1 IFN-α/β |
| 4.2.1.2 IFN-γ |
| 4.2.2 效应途径 |
| 4.2.2.1 PKR途径 |
| 4.2.2.2 2'-5'OAS途径 |
| 4.2.2.3 Mx途径 |
| 5 IFN的生物学活性 |
| 5.1 抗病毒繁殖作用 |
| 5.2 抑制细胞分裂增殖、抗肿瘤作用 |
| 5.3 免疫凋节作用 |
| 5.4 免疫佐剂作用 |
| 5.5 干扰素与机体组织系统的相互作用和影响 |
| 5.5.1 干扰素信号的负调控因素 |
| 5.5.1.1 SOCS家族 |
| 5.5.1.2 PIAS家族 |
| 5.5.1.3 PTP家族 |
| 5.5.2 干扰素与神经内分泌系统的相互作用 |
| 5.5.3 病毒对干扰素的抵抗 |
| 5.5.3.1 转录水平的抑制—病毒阻抑干扰素的诱生 |
| 5.5.3.2 病毒对干扰素信号通路的抑制 |
| 5.5.3.3 病毒对干扰素效应蛋白的抑制 |
| 6 家禽α干扰素的研究概况 |
| 7 IFN的基因工程研究及应用 |
| 7.1 IFN的基因工程研究 |
| 7.2 干扰素的应用 |
| 7.3 干扰素临床应用中的副作用问题 |
| 8 α干扰素作为免疫佐剂的研究进展 |
| 9 利用毕赤酵母表达外源蛋白的研究 |
| 9.1 分泌蛋白的翻译后修饰加工 |
| 9.2 影响外源蛋白表达的因素 |
| 第二章 研究目的与意义 |
| 第三章 鹅INF-α基因的克隆及生物信息学分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌种和质粒 |
| 1.3 主要酶和试剂 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 方法设计 |
| 2.2 引物设计 |
| 2.3 天府肉鹅外周血单核细胞的分离培养及细胞总RNA的提取 |
| 2.3.1 天府肉鹅外周血单核细胞的分离培养 |
| 2.3.2 细胞的诱导培养 |
| 2.3.3 细胞总RNA的提取 |
| 2.4 天府肉鹅IFN-α基因的扩增 |
| 2.4.1 RT-PCR反应 |
| 2.4.2 PCR扩增目的片段及检测 |
| 2.4.3 扩增产物的纯化 |
| 2.5 干扰素基因的克隆与测序 |
| 2.5.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.5.2 PCR纯化产物与克隆载体的连接 |
| 2.5.3 连接产物的转化 |
| 2.5.4 阳性重组子的鉴定 |
| 2.5.4.1 质粒的提取 |
| 2.5.4.2 重组质粒pMD18-T-GoIFN-α的双酶切鉴定 |
| 2.5.4.3 重组质粒pMD18-T-GoIFN-α的PCR鉴定 |
| 2.5.5 序列测定 |
| 2.6 天府肉鹅干扰素α的生物信息学分析 |
| 2.6.1 tf-GoIFN-α ORF基因序列分裂 |
| 2.6.2 tf-GoIFN-α基因的密码子使用法特征分析 |
| 2.6.3 信号肽分析 |
| 2.6.4 糖基化位点分析 |
| 2.6.5 跨膜区预测 |
| 2.6.6 磷酸化位点预测 |
| 2.6.7 疏水性分析 |
| 2.6.8 亚细胞定位预测 |
| 2.6.9 抗原表位分析 |
| 3.6.10 二级结构分析 |
| 2.6.11 同源性及进化树分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 天府肉鹅外周血单核细胞诱导培养结果 |
| 3.2 天府肉鹅1FN-α基因PCR扩增 |
| 3.3 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.4 重组质粒的PCR鉴定 |
| 3.5 tf-GoIFN-α基因序列 |
| 3.6 生物信息学分析 |
| 3.6.1 tf-GoIFN-αORF基因序列分析 |
| 3.6.2 tf-GoIFN-α基因的密码子使用法特征分析 |
| 3.6.2.1 不同动物IFN-α基因参数的分析 |
| 3.6.2.2 天府肉鹅IFN-α基因密码子使用频率 |
| 3.6.3 信号肽分析 |
| 3.6.4 糖基化位点分析 |
| 3.6.5 跨膜区预测 |
| 3.6.6 磷酸化位点预测 |
| 3.6.7 疏水性分析 |
| 3.6.8 抗原表位分析 |
| 3.6.9 亚细胞定位预测 |
| 3.6.10 二级结构分析 |
| 3.6.11 同源性及进化树分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 天府肉鹅IFN-α的诱导和产生 |
| 4.2 RNA的提取及基因扩增 |
| 4.3 天府肉鹅IFN-α基因的生物信息学分析 |
| 4.4 天府肉鹅IFN-α基因的密码子特征 |
| 5 小结 |
| 第四章 天府肉鹅IFN-α成熟肽基因的原核表达及抗病毒活性研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌种、质粒及毒株 |
| 1.3 主要酶和试剂 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 天府肉鹅IFN-α成熟肽基因原核表达载体的构建 |
| 2.1.1 引物设计 |
| 2.1.2 成熟肽基因的扩增 |
| 2.1.3 成熟肽基因的克隆 |
| 2.1.4 pMD18-T-mGoIFN-α和pET-32a(+)质粒的提取 |
| 2.1.5 质粒DNA的酶切和回收 |
| 2.1.6 目的基因(mGoIFN-α)和表达载体pET-32a(+)的连接 |
| 2.1.7 重组质粒的转化 |
| 2.1.8 重组质粒的鉴定 |
| 2.1.8.1 PCR鉴定 |
| 2.1.8.2 酶切鉴定 |
| 2.1.8.3 原核表达质粒的序列测定 |
| 2.2 重组蛋白的表达 |
| 2.2.1 Rosetta感受态细胞的制备 |
| 2.2.2 工程菌的诱导表达 |
| 2.2.3 诱导表达重组蛋白的条件优化 |
| 2.2.4 重组蛋白的纯化和复性 |
| 2.2.4.1 包涵体的制备 |
| 2.2.4.2 包涵体的洗涤 |
| 2.2.4.3 包涵体的溶解 |
| 2.2.4.4 透析复性 |
| 2.2.4.5 Ni-IMAC纯化复性 |
| 2.2.4.6 蛋白浓度的测定 |
| 2.3 高免血清的制备 |
| 2.3.1 蛋白疫苗的制备 |
| 2.3.2 动物免疫 |
| 2.3.3 高免血清效价检测 |
| 2.3.4 Western Blot检测 |
| 2.4 重组天府肉鹅α干扰素的抗病毒活性研究 |
| 2.4.1 天府肉鹅IFN-α抗VSV活性研究 |
| 2.4.1.1 VSV的扩增与保存 |
| 2.4.1.2 原代鹅胚成纤维细胞的制备和培养 |
| 2.4.1.3 VSV半数细胞感染量(TCID50)测定 |
| 2.4.1.4 重组天府肉鹅IFN-α抗VSV活性的测定 |
| 2.4.2 重组天府肉鹅IFN-α抗GPV的研究 |
| 2.4.2.1 GPV的接种、收获与毒价测定 |
| 2.4.2.2 荧光定量PCR检测重组天府肉鹅IFN-α抗GPV的研究 |
| 2.4.2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.4.2.2.2 标准阳性模板的制备 |
| 2.4.2.2.3 引物合理性验证及反应条件的优化 |
| 2.4.2.2.4 标准曲线制备 |
| 2.4.2.2.5 试验样品的制备 |
| 2.4.2.2.5.1 试验分组 |
| 2.4.2.2.5.2 样品制备 |
| 2.4.2.2.6 定量PCR检测 |
| 2.4.2.2.7 结果计算 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 天府肉鹅IFN-α成熟蛋白基因片段的克隆 |
| 3.2 天府肉鹅IFN-α成熟肽基因原核表达载体的构建 |
| 3.3 重组蛋白的原核表达 |
| 3.3.1 诱导时间的优化 |
| 3.3.2 IPTG诱导浓度的优化 |
| 3.3.3 天府肉鹅IFN-α成熟肽基因重组蛋白复性 |
| 3.4 高免血清效价测定 |
| 3.5 免疫兔血清的Western Blot检测 |
| 3.6 重组天府肉鹅α干扰素成熟蛋白的抗病毒活性研究 |
| 3.6.1 重组天府肉鹅IFN-α抗VSV活性研究 |
| 3.6.2 SYBR Green real-time PCR检测重组天府肉鹅IFN-α抗GPV的研究 |
| 3.6.2.1 反应条件的优化 |
| 3.6.2.2 标准曲线的建立 |
| 3.6.2.3 溶解曲线分析 |
| 3.6.2.4 SYBR Green real-time PCR检测鹅IFN-α抗GPV活性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于信号肽及成熟蛋白基因表达 |
| 4.2 关于蛋白的复性 |
| 4.3 鹅IFN-α重组蛋白抗VSV活性 |
| 4.4 SYBR Green real-time PCR测鹅IFN-α抗GPV活性 |
| 5 小结 |
| 第五章 鹅IgG的提取纯化及兔抗鹅IgG酶标抗体的制备 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物\毒株 |
| 1.2 主要酶和试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 兔抗鹅IFN-α基因蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.1.1 实验动物准备 |
| 2.1.2 鹅卵黄IgG的提纯 |
| 2.1.3 鹅卵黄IgG的鉴定 |
| 2.1.4 蛋白含量的测定 |
| 2.1.5 蛋白疫苗的制备 |
| 2.1.6 动物免疫 |
| 2.1.7 血清的分离 |
| 2.1.8 兔抗鹅IgG效价的测定 |
| 2.1.9 兔血清IgG的纯化 |
| 2.1.9.1 用辛酸-硫酸铵法粗提血清IgG |
| 2.1.9.2 DEAEA-50纤维柱层析纯化兔抗鹅血清IgG |
| 2.1.9.2.1 纤维素平衡 |
| 2.1.9.2.2 离子交换层析纯化IgG |
| 2.2 兔抗鹅IgG酶标抗体的制备 |
| 2.2.1 兔抗鹅辣根过氧化物(HRP)酶标抗体的制备 |
| 2.2.2 ELISA抗原的制备 |
| 2.2.3 间接ELISA操作方法 |
| 2.2.4 抗原最适浓度和最适鹅血清稀释度的确定 |
| 2.2.5 酶标抗体稀释度的选择 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 免疫扩散试验 |
| 3.2 抗体纯化检测 |
| 3.4 抗原包被浓度和鹅血清稀释度的确定 |
| 3.5 HRP酶标兔抗鹅二抗工作浓度的确定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于血清IgG的纯化 |
| 4.2 关于ELISA条件的优化 |
| 4.3 关于酶标二抗 |
| 5 小结 |
| 第六章 天府肉鹅IFN-α真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的瞬时表达 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌种和质粒 |
| 1.3 主要酶和试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 天府肉鹅α干扰素真核表达质粒的构建 |
| 2.1.1 菌种的培养 |
| 2.1.2 pMD-18-T-GoIFN-α质粒的提取 |
| 2.1.3 目的基因的准备 |
| 2.1.4 pcDNA3.1(+)的线性化 |
| 2.1.5 pcDNA3.1(+)的去磷酸化 |
| 2.1.6 连接反应 |
| 2.1.7 重组质粒的转化 |
| 2.1.8 重组质粒的鉴定 |
| 2.1.8.1 PCR鉴定 |
| 2.1.8.2 酶切鉴定 |
| 2.1.8.3 真核表达质粒的序列测定 |
| 2.2 pcDNA3.1-GoIFN-α在COS-7细胞中的瞬时表达 |
| 2.2.1 重组质粒pcDNA3.1-GoIFN-α转染COS-7细胞 |
| 2.2.1.1 真核表达质粒pcDNA3.1-goIFN-α的提取 |
| 2.2.1.2 COS-7细胞的准备 |
| 2.2.1.2.1 COS-7细胞复苏 |
| 2.2.1.2.2 转染前COS-7细胞的处理 |
| 2.2.1.3 脂质体法转染COS-7细胞 |
| 2.2.2 间接免疫荧光法检测pcDNA3.1-GoIFN-α的表达 |
| 2.2.3 ELISA法鉴定目的蛋白的分泌 |
| 2.2.4 Westem blot分析 |
| 2.3 pcDNA3.1-GoIFN-α生物活性的测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鹅α干扰素真核表达质粒的构建 |
| 3.2 GoIFN-α基因表达产物在COS-7细胞中的定位 |
| 3.3 GoIFN-α基因表达产物在细胞上清液中的检测 |
| 3.4 Westem-blot分析 |
| 3.5 基因表达产物GoIFN-α抗病毒检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 GoIFN-α外源蛋白在COS-7细胞中的表达 |
| 4.2 抗病毒活性的检测 |
| 5 小结 |
| 第七章 天府肉鹅IFN-α真核表达质粒的免疫佐剂效应 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌种、质粒和毒株 |
| 1.3 主要酶和试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 分子佐剂和小鹅瘟VP3基因疫苗大量制备和纯化 |
| 2.1.1 碱裂解法提取质粒,大量制备基因疫苗及佐剂 |
| 2.1.2 聚乙二醇法(PEG-8000)纯化基因疫苗及佐剂质粒 |
| 2.2 动物分组和免疫 |
| 2.3 血样的采集和处理 |
| 2.4 淋巴细胞转化试验 |
| 2.4.1 外周血淋巴细胞的分离 |
| 2.4.2 淋巴细胞的诱导培养 |
| 2.4.3 检测及数据处理 |
| 2.5 血清IgG的变化 |
| 2.5.1 ELISA抗原的制备 |
| 2.5.2 血清抗体IgG检测 |
| 2.5.3 结果分析 |
| 2.6 中和抗体水平的检测 |
| 2.6.1 小鹅瘟强毒的培养 |
| 2.6.2 抗体水平检测 |
| 2.6.3 计算中和指数 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和佐剂后淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 3.1.1 鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和不同剂量的佐剂后淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 3.1.2 鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和不同佐剂后淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 3.1.3 鹅免疫GPV-VP3基因疫苗及佐剂后淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 3.2 间接ELISA检测鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和佐剂后的IgG动态变化结果 |
| 3.2.1 间接ELISA检测鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和不同剂量佐剂后的IgG动态变化 |
| 3.2.2 间接ELISA检测鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和不同佐剂后的IgG动态变化 |
| 3.2.3 间接ELISA检测鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和佐剂后的IgG动态变化 |
| 3.3 小鹅瘟强毒TCID_(50)的测定 |
| 3.4 中和抗体试验检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于细胞免疫和淋巴细胞体外增殖的关系 |
| 4.2 关于IFN-α的分子免疫佐剂功能 |
| 5 小结 |
| 第八章 天府肉鹅α干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒活性研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌种、质粒和病毒 |
| 1.2 主要酶和试剂 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 天府肉鹅α干扰素成熟肽基因的克隆 |
| 2.1.1 引物设计及合成 |
| 2.1.2 基因扩增 |
| 2.1.3 成熟肽基因的克隆 |
| 2.2 酵母表达载体的构建 |
| 2.2.1 pMD18-T-m2GoIFN-α和pPICZαA质粒的提取 |
| 2.2.2 质粒DNA的酶切和回收 |
| 2.2.3 目的基因(mGoIFN-α)与表达载体pPICZαA的连接 |
| 2.2.4 连接产物的转化 |
| 2.2.5 酵母表达载体的鉴定 |
| 2.2.5.1 PCR鉴定 |
| 2.2.5.2 酶切鉴定 |
| 2.2.5.3 酵母表达载体的序列测定 |
| 2.3 天府肉鹅IFN-α在毕赤酵母中的表达 |
| 2.3.1 重组酵母的构建 |
| 2.3.1.1 空载体pPICZαA及表达载体pPICZαA-GoIFN-α的线性化 |
| 2.3.1.1.1 SacⅠ单酶切 |
| 2.3.1.1.2 线性化质粒的纯化 |
| 2.3.1.2 受体菌X-33感受态细胞的制备 |
| 2.3.1.3 酵母菌的电转化 |
| 2.3.1.3.1 电转仪参数的设置 |
| 2.3.1.3.2 电转化操作 |
| 2.3.1.4 重组鹅α干扰素基因酵母菌株的鉴定 |
| 2.3.1.4.1 重组酵母基因组DNA的提取 |
| 2.3.1.4.2 PCR鉴定 |
| 2.3.2 重组酵母菌株的诱导表达 |
| 2.3.2.1 Mut+型重组酵母菌株的初步表达 |
| 2.3.2.2 高拷贝重组酵母菌株的筛选 |
| 2.3.2.3 重组酵母菌株的表达条件的优化 |
| 2.3.2.3.1 诱导表达时间的优化 |
| 2.3.2.3.2 甲醇浓度的优化 |
| 2.3.2.3.3 双抗体夹心ELISA检测表达条件的优化 |
| 2.3.3 重组酵母表达产物的SDS-PAGE和Western-blot分析 |
| 2.3.3.1 配制SDS-PAGE凝胶 |
| 2.3.3.2 SDS-PAGE |
| 2.3.3.3 表达产物的Western-blot分析 |
| 2.4 重组天府肉鹅α干扰素抗病毒活性检测 |
| 2.4.1 酵母表达产物的纯化 |
| 2.4.1.1 透析袋的预先处理 |
| 2.4.1.2 重组IFN-α的纯化 |
| 2.4.2 抗病毒活性检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 成熟肽基因的克隆 |
| 3.2 酵母表达载体的构建 |
| 3.3 酵母转化子的鉴定 |
| 3.4 斑点法筛选高表达菌株 |
| 3.5 诱导表达条件的优化 |
| 3.6 表达产物的SDS-PAGE |
| 3.7 Western-blot检测 |
| 3.8 重组天府肉鹅IFN-α酵母表达产物的抗病毒活性检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于表达系统的选择 |
| 4.2 关于毕赤酵母转化方法的选取 |
| 4.3 关于酵母表达的糖基化 |
| 4.4 天府肉鹅α干扰素酵母表达产物的抗病毒活性 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间文章完成情况 |
（10）鸭瘟病毒UL51基因部分特性及其基因工程蛋白应用的研究（论文提纲范文）
| 本论文的创新性工作 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 常用英文缩写词汇 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 疱疹病毒UL51基因及其编码蛋白的研究进展 |
| 1. 疱疹病毒UL51基因的特点 |
| 1.1 疱疹病毒UL51基因在基因组中定位 |
| 1.2 疱疹病毒UL51基因的类型 |
| 2. 疱疹病毒UL51基因编码蛋白的特点 |
| 2.1 UL51基因编码蛋白的表达和基本特性 |
| 2.2 UL51基因编码蛋白的定位特性 |
| 2.2.1 UL51蛋白的亚细胞定位 |
| 2.2.2 UL51蛋白在病毒自身内的定位 |
| 3. 疱疹病毒UL51蛋白的功能 |
| 3.1 疱疹病毒的装配概述 |
| 3.2 疱疹病毒皮层蛋白的功能概述 |
| 3.3 疱疹病毒UL51蛋白功能的研究进展 |
| 4. 疱疹病毒UL51蛋白与其它蛋白的相互作用 |
| 5. 展望 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第二章 DPV UL51基因的序列特征及密码子偏爱性分析 |
| 摘要 |
| 1. 试验数据 |
| 2. 试验方法 |
| 2.1 DPV UL51基因的生物信息学分析方法 |
| 2.2 DPV UL51基因的密码子偏爱性分析方法 |
| 3. 试验结果 |
| 3.1 DPV UL51蛋白质序列生物信息学分析 |
| 3.1.1 DPV UL51基因编码蛋白的保守结构区 |
| 3.1.2 DPV UL51基因的系统进化分析 |
| 3.1.3 DPV UL51基因编码蛋白的基本理化性质 |
| 3.1.4 DPV UL51基因编码蛋白的亚细胞定位分析结果 |
| 3.1.5 DPV UL51蛋白翻译后修饰预测 |
| 3.1.6 DPV UL51蛋白的疏水性分析 |
| 3.1.7 DPV UL51蛋白的抗原性分析 |
| 3.1.8 DPV UL51蛋白的二级结构分析 |
| 3.1.9 DPV UL51蛋白的三级结构分析 |
| 3.2 DPV UL51基因密码子偏爱性分析 |
| 3.2.1 DPV与17种疱疹病毒间UL51基因密码子使用偏爱分析 |
| 3.2.2 DPV UL51基因密码子使用频率和氨基酸组成偏爱分析 |
| 3.2.3 DPV UL51基因与大肠杆菌、酵母及人的密码子使用偏爱性比较 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 DPV UL51蛋白与其它α-疱疹病毒UL51蛋白的系统进化关系 |
| 4.2 DPV UL51蛋白一般理化特征 |
| 4.3 DPV UL51蛋白亚细胞定位预测 |
| 4.4 DPV UL51蛋白翻译后修饰 |
| 4.5 DPV UL51蛋白的抗原性和高级结构特点 |
| 4.6 DPV UL51基因密码子偏爱性分析及其对表达的影响 |
| 5. 小结 |
| Abstract |
| 第三章 鸭瘟病毒UL51基因的克隆、原核表达、产物纯化及其多克隆抗体制备 |
| 摘要 |
| 1. 试验材料 |
| 1.1 菌株、质粒和毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂及其配制 |
| 1.3.1 基因克隆表达相关试剂 |
| 1.3.2 SDS-PAGE电泳相关试剂 |
| 1.3.3 琼脂糖电泳相关试剂 |
| 1.3.4 弗氏佐剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2. 试验方法 |
| 2.1 DPV UL51基因的克隆 |
| 2.1.1 引物设计 |
| 2.1.2 DPV基因组DNA的提取 |
| 2.1.3 PCR扩增DPV UL51基因 |
| 2.1.4 UL51基因PCR产物的回收 |
| 2.1.5 纯化的UL51基因与pMD18-T的连接 |
| 2.1.6 DH5a感受态细胞的制备 |
| 2.1.7 转化感受态细胞 |
| 2.1.8 质粒的抽提 |
| 2.1.9 重组质粒的PCR和酶切鉴定 |
| 2.1.10 UL51基因序列测定 |
| 2.2 原核表达质粒pET28a-UL51的构建、诱导表达与条件优化 |
| 2.2.1 原核表达质粒pET28a-UL51的构建与鉴定 |
| 2.2.2 重组表达质粒pET28a-UL51的诱导表达 |
| 2.2.3 重组质粒pET28a-UL5 1诱导条件的优化 |
| 2.3 重组UL51蛋白的大量制备、纯化与复性 |
| 2.3.1 重组UL51蛋白的大量制备(包涵体处理) |
| 2.3.2 重组UL51蛋白的纯化 |
| 2.3.3 重组UL51蛋白的复性 |
| 2.4 兔抗重组UL51蛋白抗体的制备、效价测定与纯化 |
| 2.4.1 兔抗重组UL51蛋白高免血清的制备 |
| 2.4.2 兔抗重组UL51蛋白高免血清效价测定 |
| 2.4.3 兔抗重组UL51蛋白抗体IgG的纯化 |
| 3. 试验结果 |
| 3.1 DPV UL51基因的扩增、T-克隆与鉴定结果 |
| 3.1.1 UL51基因的PCR扩增结果 |
| 3.1.2 UL51基因T克隆鉴定结果 |
| 3.2 原核表达质粒pET28a-UL51的构建与鉴定、诱导表达及其优化结果 |
| 3.2.1 重组表达质粒pET28a-UL51的构建与酶切鉴定 |
| 3.2.2 重组质粒pET28a-UL51的诱导表达 |
| 3.2.3 重组质粒pET28a-UL51诱导表达条件的优化 |
| 3.3 重组UL51蛋白的纯化结果 |
| 3.4 兔抗重组UL51蛋白抗体的效价测定与纯化结果 |
| 3.4.1 兔抗重组UL51蛋白高免血清效价测定 |
| 3.4.2 兔抗重组UL51蛋白抗体IgG的纯化 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 基因的引物设计和克隆测序 |
| 4.2 表达系统的选择 |
| 4.3 疱疹病毒UL51基因的原核表达 |
| 4.4 兔抗重组UL51蛋白抗体的制备和纯化 |
| 5. 小结 |
| Abstract |
| 第四章 鸭瘟病毒UL51基因在感染宿主细胞中的转录和表达特征 |
| 摘要 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 病毒和抗体 |
| 1.2试验动物 |
| 1.3 主要试剂及其配制 |
| 1.3.1 细胞培养相关试剂 |
| 1.3.2 Western blotting相关试剂 |
| 1.4 主要仪器和用品 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 荧光定量RT-PCR方法检测DPV UL51基因在感染宿主细胞中的转录时相 |
| 2.1.1 引物设计与合成 |
| 2.1.2 细胞培养及采样 |
| 2.1.3 总RNA提取 |
| 2.1.4 去除RNA中的DNA |
| 2.1.5 RNA完整性及纯度测定 |
| 2.1.6 逆转录 |
| 2.1.7 目的片段的PCR扩增及回收 |
| 2.1.8 荧光定量PCR |
| 2.1.9 荧光定量PCR扩增标准曲线的建立 |
| 2.1.10 数据分析和处理 |
| 2.2 Western blotting检测DPV UL51基因在感染宿主细胞中的表达时相 |
| 2.2.1 细胞培养及采样时间 |
| 2.2.2 细胞样品处理和SDS-PAGE电泳 |
| 2.2.3 Western blotting检测 |
| 2.3 Westem blotting检测DPV UL51基因表达产物是否为DPV粒子的组成成分 |
| 2.3.1 细胞培养及病毒纯化 |
| 2.3.2 Westem blotting检测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 DPV UL51基因在宿主细胞中的转录时相分析结果 |
| 3.1.1 RNA完整性及纯度分析 |
| 3.1.2 RT-PCR检测 |
| 3.1.3 荧光定量PCR检测标准曲线的建立 |
| 3.1.4 DPV UL51基因在宿主细胞中的转录量分析 |
| 3.2 DPV UL51基因在宿主细胞中的表达时相分析结果 |
| 3.2.1 细胞蛋白的提取及SDS-PAGE检测 |
| 3.2.2 DPV UL51基因产物在宿主细胞中的表达时相分析 |
| 3.3 DPV UL51基因表达产物是DPV粒子的一种组成成分 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DPV UL51基因在宿主细胞中的转录时相分析 |
| 4.1.1 实时荧光定量RT-PCR方法检测DPV UL51基因在宿主细胞中的转录时相方法的建立与优化 |
| 4.1.2 疱疹病毒UL51基因转录时相的比较 |
| 4.2 DPV UL51基因在宿主细胞中的表达时相分析 |
| 4.2.1 Western blotting方法检测DPV UL51基因在宿主细胞中的表达时相分析 |
| 4.2.2 疱疹病毒UL51蛋白表达时相的比较 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第五章 鸭瘟病毒UL51蛋白在病毒感染细胞中的定位 |
| 摘要 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 病毒、抗体和细胞 |
| 1.2 主要试剂及其配制 |
| 1.2.1 细胞固定液 |
| 1.2.2 封片剂 |
| 1.3 主要仪器和用品 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白细胞内的定位 |
| 2.1.1 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白细胞内的定位方法的建立 |
| 2.1.2 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白的细胞内定位方法的条件优化 |
| 2.1.3 特异性检测 |
| 2.1.4 免疫荧光检测结果判定 |
| 2.1.5 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白的细胞内定位的动态监测 |
| 2.2 胶体金免疫电镜法检测DPV UL51蛋白的亚细胞定位 |
| 2.2.1 胶体金免疫电镜法检测DPV UL51蛋白的亚细胞定位方法的建立 |
| 2.2.2 胶体金免疫电镜法检测DPV UL51蛋白亚细胞定位方法的条件优化 |
| 2.2.3 特异性试验 |
| 2.2.4 胶体金免疫电镜法检测结果判定 |
| 2.2.5 胶体金免疫电镜法检测DPV UL51蛋白在病毒感染细胞中的亚细胞定位的动态监测 |
| 3 结果 |
| 3.1 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白细胞内的定位 |
| 3.1.1 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白的细胞内定位方法的建立及优化 |
| 3.1.2 特异性试验 |
| 3.1.3 间接免疫荧光法检测UL51蛋白在DPV感染细胞中的定位动态 |
| 3.2 胶体金免疫电镜法检测DPV UL51蛋白的亚细胞定位 |
| 3.2.1 胶体金免疫电镜法检测DPV UL51蛋白的亚细胞定位方法的建立及优化 |
| 3.2.2 特异性试验 |
| 3.2.3 胶体金免疫电镜法检测DPV UL51蛋白在DPV病毒感染的细胞中的亚细胞定位动态 |
| 4 讨论 |
| 4.1 特定蛋白在细胞定位的方法简介 |
| 4.2 DPV UL51基因表达产物在宿主细胞定位与病毒增殖的关系分析 |
| 4.3 疱疹病毒UL51蛋白的亚细胞定位与其功能的关系 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第六章 用免疫组化方法检测DPV UL51蛋白在人工感染鸭组织中的定位和动态分布 |
| 摘要 |
| 1. 试验材料 |
| 1.1 毒株和抗体 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂及其配制 |
| 1.3.1 组织固定、脱水和包埋 |
| 1.3.2 所需主要溶液的配置 |
| 1.3.3 免疫酶组化SP法所需试剂 |
| 1.3.4 免疫荧光所需试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2. 试验方法 |
| 2.1 人工感染动物试验 |
| 2.1.1 试验分组 |
| 2.1.2 人工感染及样品的采集、固定、包埋和切片 |
| 2.2 免疫酶组织化学检测DPV UL51蛋白组织定位方法的建立及优化 |
| 2.2.1 免疫酶组织化学检测DPV UL51蛋白组织定位方法的建立 |
| 2.2.2 免疫酶组织化学检测DPV UL51蛋白组织定位条件的优化 |
| 2.2.3 特异性试验 |
| 2.2.4 免疫酶组织化学法的检测结果判定 |
| 2.2.5 免疫酶组织化学检测DPV UL51蛋白在人工感染鸭各组织中的定位和动态分布 |
| 2.3 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白组织定位方法的建立与优化 |
| 2.3.1 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白组织定位方法的建立 |
| 2.3.2 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白组织定位条件的优化 |
| 2.3.3 特异性试验 |
| 2.3.4 免疫荧光检测结果判定 |
| 2.3.5 间接免疫荧光检测石蜡切片中DPV UL51蛋白在人工感染鸭各组织中的定位和动态分布 |
| 3. 试验结果 |
| 3.1 人工感染DP强毒后鸭的临床症状及大体解剖病理变化 |
| 3.2 免疫酶组织化学检测DPV UL51蛋白在鸭组织中的定位与分布 |
| 3.2.1 免疫酶组化检测DPV UL51蛋白组织定位方法的优化结果 |
| 3.2.2 异性试验 |
| 3.2.3 免疫酶组织化学检测DPV UL51蛋白在人工感染鸭各组织中的定位和动态分布结果 |
| 3.3 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白在鸭组织中的定位与分布 |
| 3.3.1 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白组织定位方法的优化结果 |
| 3.3.2 异性试验 |
| 3.3.3 间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白在人工感染鸭各组织中的定位和动态分布结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 免疫酶组化和间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白的定位方法的建立与优化 |
| 4.1.1 免疫酶组化法检测DPV UL51蛋白的定位方法的建立与优化 |
| 4.1.2 间接免疫荧光法检测DPV UL51蛋白的定位方法的建立与优化 |
| 4.2 免疫酶组化和间接免疫荧光检测DPV UL51蛋白在人工感染鸭各组织中的定位与分布结果及二者的比较 |
| 4.2.1 免疫酶组化法检测DPV UL51蛋白在人工感染鸭各组织中的定位与分布结果 |
| 4.2.2 间接免疫荧光法检测DPV UL51蛋白在人工感染鸭各组织中的定位与分布结果 |
| 4.2.3 不同方法检测DPV UL51蛋白在人工感染鸭体内的定位及分布规律比较 |
| 5. 小结 |
| Abstract |
| 第七章 基于重组UL51蛋白的间接ELISA法和胶体金免疫层析试纸条法检测鸭瘟病毒抗体的研究和应用 |
| 摘要 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 菌株、毒株和血清 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.2.1 ELISA相关溶液 |
| 1.3 主要仪器及用品 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 重组UL51蛋白的大量制备和纯化 |
| 2.1.1 菌体发酵培养 |
| 2.1.2 重组ULL51蛋白的包涵体洗涤法大量纯化 |
| 2.1.3 重组UL51蛋白的复性和检测 |
| 2.2 UL51-ELISA法检测DPV抗体方法的建立 |
| 2.2.1 最佳抗原包被浓度的确定 |
| 2.2.2 待检血清和酶标二抗最佳稀释度的确定 |
| 2.2.3 UL51-ELISA方法的检测程序 |
| 2.2.4 UL51-ELISA阴阳性临界值的确定 |
| 2.2.5 敏感性试验 |
| 2.2.6 特异性试验 |
| 2.2.7 重复性试验 |
| 2.3 UL51-ICS法检测DPV抗体方法的建立 |
| 2.3.1 ICS的组装 |
| 2.3.2 UL51-ICS法的原理和结果判定 |
| 2.3.3 UL51-ICS法的最佳试验条件的优化 |
| 2.3.4 敏感性试验 |
| 2.3.5 特异性试验 |
| 2.3.6 重复性试验 |
| 2.3.7 稳定性试验 |
| 2.4 UL51-ELISA法和UL51-ICS法检测DPV抗体的应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 纯化的重组UL51蛋白的检测结果 |
| 3.2 UL51-ELISA法的建立 |
| 3.2.1 最佳抗原包被浓度确定的结果 |
| 3.2.2 待检血清和酶标抗体最适度的确定 |
| 3.2.3 ELISA阴阳性临界值的确定 |
| 3.2.4 敏感性试验 |
| 3.2.5 特异性试验结果 |
| 3.2.6 重复性试验结果 |
| 3.3 UL51-ICS方法的建立 |
| 3.3.1 UL51-ICS法检测DPV抗体法的条件优化 |
| 3.3.2 敏感性试验结果 |
| 3.3.3 特异性试验结果 |
| 3.3.4 重复性试验结果 |
| 3.3.5 稳定性试验结果 |
| 3.4 地方血清样品检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 重组蛋白的优点及应用 |
| 4.2 UL51-ELISA法的建立与优化 |
| 4.3 UL51-ICS方法的建立与优化 |
| 4.4 UL51-ELISA法、UL51-ICS法、DPV-ELISA法和NT法的比较 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第八章 基于抗重组UL51蛋白抗体的抗原捕获ELISA法和胶体金免疫层析试纸条法检测DPV的研究和应用 |
| 摘要 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 蛋白、毒株和泄殖腔棉拭纸 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器及用品 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 抗重组UL51蛋白多克隆抗体的制备和纯化 |
| 2.1.1 兔抗重组UL51蛋白多克隆抗体的制备和纯化 |
| 2.1.2 鼠抗重组UL51蛋白多克隆抗体的制备、纯化和胶体金标记 |
| 2.2 样品的处理 |
| 2.2.1 细胞培养液、鸭胚尿囊液或菌体培养液的处理 |
| 2.2.2 泄殖腔棉拭子样品的处理 |
| 2.3 基于抗重组UL51蛋白抗体的AC-ELISA法检测DPV方法的建立 |
| 2.3.1 最佳鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG和兔抗重组UL51蛋白抗体IgG工作浓度的确定 |
| 2.3.2 酶标抗体最适浓度的确定 |
| 2.3.3 阴阳性临界值的确定 |
| 2.3.4 敏感性试验 |
| 2.3.5 灵敏度试验 |
| 2.3.6 重复性试验 |
| 2.4 基于抗重组UL51蛋白抗体的ICS法的建立 |
| 2.4.1 胶体金标记的兔抗重组UL51蛋白抗体的制备 |
| 2.4.2 ICS的组装 |
| 2.4.3 ICS法的原理和结果判定 |
| 2.4.4 试纸条最佳试验条件的优化 |
| 2.4.5 敏感性试验 |
| 2.4.6 特异性试验 |
| 2.4.7 重复性试验 |
| 2.4.8 稳定性试验 |
| 2.5 基于抗重组UL51蛋白抗体的AC-ELISA法和ICS法检测DPV的应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 纯化的重组UL51蛋白抗体的检测结果 |
| 3.2 基于抗重组UL51蛋白抗体的AC-ELISA方法的建立 |
| 3.2.1 鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG和兔抗重组UL51蛋白抗体IgG最佳工作浓度确定的结果 |
| 3.2.2 酶标抗体最适浓度的确定结果 |
| 3.2.3 阴阳性临界值的确定结果 |
| 3.2.4 特异性试验 |
| 3.2.5 敏感性检测结果 |
| 3.2.6 重复性试验结果 |
| 3.3 基于抗重组UL51蛋白抗体的ICS法的建立 |
| 3.3.1 基于抗重组UL51蛋白抗体的ICS法的条件优化 |
| 3.3.2 敏感性试验结果 |
| 3.3.3 特异性试验 |
| 3.3.4 重复性试验结果 |
| 3.3.5 稳定性试验结果 |
| 3.4 基于抗重组UL51蛋白抗体的AC-ELISA法和ICS法检测DPV的应用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 样品处理方法的选择 |
| 4.2 基于抗重组UL51蛋白抗体的抗原捕获ELISA法的建立与优化 |
| 4.3 基于抗重组UL51蛋白抗体的ICS方法的建立与优化 |
| 4.4 基于抗重组UL51蛋白抗体的AC-ELISA法、ICS法和常规PCR法的比较 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 第九章 鸭瘟病毒UL51基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时转录和表达特性 |
| 摘要 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 病毒、菌株、载体、细胞和抗体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和用品 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 DPV UL51基因的克隆 |
| 2.1.1 引物设计 |
| 2.1.2 DPV基因组DNA的提取 |
| 2.1.3 PCR扩增DPV UL51基因 |
| 2.1.4 UL51基因PCR产物的回收 |
| 2.1.5 纯化的UL51基因与pMD18-T的连接 |
| 2.1.6 DH5a感受态细胞的制备 |
| 2.1.7 转化感受态细胞 |
| 2.1.8 质粒的抽提 |
| 2.1.9 重组质粒的PCR和酶切鉴定 |
| 2.1.10 UL51基因序列测定 |
| 2.2 真核表达质粒pcDNA3.1-UL51的构建与鉴定 |
| 2.2.1 目的片段的酶切与连接 |
| 2.2.2 重组质粒的转化 |
| 2.2.3 重组质粒的酶切和PCR鉴定 |
| 2.3 UL51基因在COS-7细胞中的瞬时转录和表达特性分析 |
| 2.3.1 重组真核表达载体pcDNA3.1-UL51转染COS-7细胞 |
| 2.3.2 荧光定量RT-PCR方法检测UL51基因在COS-7细胞中的瞬时转录 |
| 2.3.3 Western blotting检测UL51基因在COS-7细胞中的瞬时表达 |
| 2.3.4 间接免疫荧光法检测UL51基因表达产物在COS-7细胞中的定位 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 DPV UL51基因的扩增、T-克隆与鉴定结果 |
| 3.1.1 UL51基因的PCR扩增结果 |
| 3.1.2 UL51基因T克隆鉴定结果 |
| 3.2 真核表达载体pcDNA3.1-UL51的构建与酶切鉴定 |
| 3.3 UL51基因在COS-7细胞中的转录情况 |
| 3.3.1 RNA完整性及纯度分析 |
| 3.3.2 UL51基因在COS-7细胞中的相对转录量分析 |
| 3.4 UL51基因在COS-7细胞中的表达情况 |
| 3.4.1 细胞蛋白的提取及SDS-PAGE检测 |
| 3.4.2 UL51基因表达产物在在COS-7细胞中的表达时相分析 |
| 3.5 UL51基因表达产物在COS-7细胞中的定位 |
| 4 讨论 |
| 4.1 真核表达载体、转染试剂、宿主细胞的选择 |
| 4.2 UL51基因转录和表达产物的检测 |
| 5 小结 |
| Abstract |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介以及攻读博士学位期间发表的学术论文 |
四、基因及其表达调控中遗传密码选择的偏爱性（论文参考文献）
- [1]IGF-1 c.258A>G同义突变小鼠模型的构建及其功能解析[D]. 王思瑶. 吉林大学, 2021(01)
- [2]高致病性冠状病毒密码子偏爱性分析及S蛋白真核表达重组质粒的构建[D]. 田明明. 大理大学, 2019
- [3]托桂型芍药花型形成的相关基因筛选及其调控机制研究[D]. 吴彦庆. 扬州大学, 2019(06)
- [4]解脂耶氏酵母促进菌丝形成转录因子Mhy1的启动子、靶基因及结合位点的鉴定[D]. 吴恒. 武汉大学, 2019(06)
- [5]温度影响苎麻纤维品质转录组解析及特异型启动子鉴定[D]. 郭平安. 华中农业大学, 2018
- [6]猪IGF1R外显子SNPs筛查及IGF1R胞内结构域SNPs对其表达水平的影响[D]. 吴庆燕. 吉林大学, 2017(01)
- [7]陆地棉产量、纤维品质等性状与SSR标记的关联分析[D]. 郭玉平. 山东农业大学, 2013(05)
- [8]鸭瘟病毒gE基因功能初步研究[D]. 常华. 四川农业大学, 2011(02)
- [9]天府肉鹅α干扰素基因克隆、表达及其生物学活性研究[D]. 刘菲. 四川农业大学, 2011(02)
- [10]鸭瘟病毒UL51基因部分特性及其基因工程蛋白应用的研究[D]. 沈婵娟. 四川农业大学, 2010(12)